انجام پایان نامه

درخواست همکاری انجام پایان نامه  بانک مقالات رایگان انجام پایان نامه

سفارش پایان نامه

|

انجام پایان نامه ارشد

 پایان نامه

پایان نامه اصلاح نباتات

پایان نامه


چكيده:
  بوجود آمده است. B.oleracea وB.rapaهایكلزا گياهي آلو تترا پلوئيدست.كه از تلاقي بين گونه
يكي از روشهاي ٬ كشت ميكروسپور كلزا و سپس باززايي جنينهاي بدست آمده از كشت ميكروسپور مي باشد. دراين تحقيق که در سازمان انرژی اتمی اجرا شد مشخص گردید که استقاده از تيمارهاي مختلف٬ در ميزان باززايي جنین ها موثر است. در آزمايش اول اثرتراكمهاي مختلف ( ml٬20000 ml30000 وml 40000)ميكروسپور بر روي جنين زايي ميكروسپورهاي كلزا در رقم گلوبال مورد بررسي قرار گرفت. نتايج نشان داد كه هر سه تراكم در سطح 1%با هم اختلاف معني داري دارند . تراكمml 40000 ميكروسپور (باتوليد 33/1031 جنين) بالاترين و تراكمml 20000 ميكروسپور ( با توليد 72/137 جنين) پايين ترين گروه ميزان جنين زايي را  داشتند.درحالیکه تراکمml 30000 میکروسپوربا52/413جنین در گروه حدواسط  قرارگرفت.درآزمایش دیگراثراندازه های مختلف جنین بر روی صفات باززایی جنینهای حاصل از کشت میکروسپورهای کلزا در رقم گلوبال موردمطالعه قرارگرفت٬ که این صفات عبارت بودنداز:1.تولیدنوساقه:که درجنینهای بزرگتر از 6میلیمتر دارای بیشترین مقدارست.2.کالزایی برروی لپه:که اندازه های مختلف جنین در سطح1%و5% اختلاف معنی داری با هم ندارند.3.تولیدبرگ:که در جنین های بزرگتر از 6 میلیمتردارای بیشترین مقدارست.4.تولیدجوانه های نابجا:که درجنینهای 5تا6 میلیمتری دارای بیشترین مقدارست.5.ریشه زایی:که در سطح 1%دارای اختلاف معنی داری میباشد.در آزمایش دیگر مطالعه اثر استفاده  از  کاغذ  صافی در  میزان  طول  ریشه  ٬ ارتفاع گیاهچه ودرصد تولید گیاهچه های نرمال در دو رقم گلوبال و آپشن  مورد مطالعه قرار گرفت . نتایج حاصل از این آزمایش در میزان طول ریشه  ٬ارتفاع گیاهچه وتولید گیاهان نرمال بیانگر آنست که در رقم گلوبال در دو حالت با کاغذ و بدون کاغذ فیلتر نسبت به  رقم  آپشن  دارای  طول ریشه و ارتفاع گیاهچه بیشتری بودند . ولی در حالت اثر متقابل نوع رقم  با کاغذ  فیلتر دارای اختلاف معنی داری  نبودند در آزمایش دیگر اثر  استفاده  از شوک  سرمایی بر  روی  درصد تشکیل  گیاهچه های طبیعی در دو رقم گلوبال  و آپشن مورد مطالعه قرار گرفت . که در  این آزمایش مشاهده شد که تشکیل گیاهچه های طبیعی در دمای  4 درجه به مدت 10 روز در دو رقم گلوبال و آپشن با95/55% دارای بیشترین مقدار تولید بودند.                                           
کلماتکلیدی:کلزا٬کشتمیکروسپور٬کاغذفیلتروباززاییگیاهنرمال  
1-    مقدمه   :
گياه كلزا مهمترين گونه زراعي جنس براسيكا (Brassica) ميباشد. و ويژگيهاي خاص اين گياه يعني قابليت كشت در نقاط مختلف ، در صد بالاي روغن آن ، كيفيت مطلوب روغن ، كاربرد روغن آن در صنايع نساجي و پلاستيك و نيز استفاده از كنجاله آن در تغذيه دام سبب شده است كه توسعه كشت اين گياه بعنوان نقطه اميدي جهت تامين روغن خام مورد نياز كشور و رهائي از وابستگي بشمار رود .بطوريكه در حال حاضر كلزا نقطه ثقل طرحهاي افزايش توليد دانه هاي روغني محسوب ميگردد. دانه‎هاي روغني قسمت مهمي از توليد محصولات كشاورزي را شامل مي‎شوند، چون علاوه بر مصارف صنعتي از لحاظ تغذيه نيز اهميت بسزايي دارند. سطح زير کشت دانه‌هاي روغني در سال  1383  (بجز کنجد که در سيستم روغن کشي وارد نمي‌شود) 319 هزار هکتار و محصول توليد شده (دانه) حدود 400 هزار تن بوده ‌است. مصرف روغن نباتي در سال 1383 بالغ بر 1180 هزار تن بوده‌است که 170 هزار تن از آن معادل حدود 4/14 درصد، از توليد داخل تامين شده ‌است ( بي نام ، 1382 ).  كلزا به عنوان يك گياه روغني با بيش از 40% روغن در دانه از گياهان مهم جهت توسعه كشت نباتات روغني وتوليد روغن نباتي در ايران است. كلزا با نام علمي Brassica napus  و نام انگليسي Rapeseed گياهي از تيره Brassicacea  ( چليپائيان يا شب بو ) مي‎باشد كه پس از سويا و نخل روغني مقام سوم را در تأمين روغن نباتي جهان به خود اختصاص داده است كه در حدود 7/14% كل توليد روغن نباتي جهان را تأمين مي‎كند. اين گياه در برابر خشكي و سرما مقاوم بوده و به دليل سازگاري، دامنه كشت وسيعي دارد  ( دهشيري 1378 ). روشهاي سنتي (كلاسيك) اصلاح نباتات از دير باز براي توليد گياهان زراعي برتر مورد استفاده قرار ميگرفته است كه مبتني بر ايجاد تغيير در ساختار ژنتيكي گياه كامل در جهت هدف خاصي با استفاده از تلاقيهاي بین جنسي ودرون جنسی بوده است.
روشهاییكه جهت اصلاح گياهان خود گشن بكار گرفته ميشوند٬ عمدتا روشهاي گزينش (Selection) و يا دورگ گيري (Hybridization) است كه در مورد اول از تنوع ژنتيكي موجود در توده هاي طبيعي و بومي استفاده شده و واريته هاي اصلاح شده اي كه نسبت به جامعه اوليه برتري هائي از نظر كمي و كيفي دارند بوجود مي آیند. شانس موفقيت در اين روش نسبتا كم است زيرا به غناي ژنتيكي توده هاي محلي بستگي دارد كه امروزه رو به كاهش بوده و كمتر قابل دسترسي است. در مقابل روشهاي مبتني بر تلاقي به اصلاحگر اين امكان را ميدهد كه بطور هدفدار صفات مطلوب واريته هاي مختلف را با يكديگر تلفيق نمايد(Poehlman and Mitton , 2003).
يك پروژه اصلاح نباتات از زمان انجام دورگ گيري تا آماده شدن واريته جهت كشت ، حدودا 10 تا 15 سال زمان صرف می شود لذا امروزه متخصصين اصلاح نباتات به دنبال روشهائي هستند كه بتوان اين مدت زمان را به حداقل ممكن رسانيد تا در وقت و هزينه هاي سنگين برنامه هاي اصلاح نباتات صرفه جوئي شود. براي اين كار سعي بر اينست كه بتوان با ايجاد تغیيرات ژنتيكي در سطح سلول ، زمان لازم براي تهيه ارقام پر محصول با كيفيت بالا و مقاوم به بيماري و يا تنشهاي محيطي را در برنامه هاي به نژادي كوتاه كرد(اصلاني و همكاران ، 1381).  
كلزا گياهي‎ خودگشن‎-‎ دگرگشن مي‎باشد ودرصد دگرگشني آن در ارقام مختلف بين 33%-22% گزارش شده است ( شهيدي و فروزان ، 1376 ). اين گياه آلوتتراپلوييد (38=x4=n 2) مي‎باشد.روشهاي سنتي اصلاح نباتات در چند دهة اخير نقش بسيار مهمي در اصلاح عملكرد و كيفيت كلزا داشته اند كه از ميان اين روشها مي توان به روش انتخاب توده اي  و گزينش شجره اي   اشاره كرد. از معايب اين روشها طولاني بودن دورة آنها مي باشد. امروزه متخصصين اصلاح نباتات به دنبال روشهاي ديگري هستند كه بتوانند اين مدت را به حداقل ممكن برسانند تا در وقت و هزينه هاي سنگين برنامه هاي اصلاح نباتات صرفه جويي شود.  يكي از اين روشها اصلاح از طريق سيستم دابل هاپلوئيدي  مي باشد، كه به عنوان وسيله اي براي تركيب صفات يك تلاقي مي تواند مكمل روش شجره اي باشد. اهميت استفاده از گياهان هاپلوئيد در برنامه هاي اصلاح نباتات از مدتها پيش براي دانشمندان مسلم گرديده است و يكي از موضوعات مهم تحقيقاتي در اين زمينه، توليد لاينهاي هموزيگوس جهت توليد گياهان هيبريد در گونه هاي خودناسازگار مي باشد. با توليد لاينهاي كاملاً هموزيگوت در اين روش 5-3 سال در زمان برنامه هاي اصلاحي صرفه جويي مي شود. سيستم دابل هاپلوئيدي در صورتي موفق است که به توان گياهان هاپلوئيد ودابل هاپلوئيد توليد کرد، بدين منظور قبل از استفاده از اين سيستم آزمايشاتي را در جهت  بهينه سازي گياهان مي بايست انجام داد. روشهاي متعددي جهت توليد گياهان هاپلوئيد و به دنبال آن گياهان دابل هاپلوئيد وجود دارد كه يكي از اين روشها آندروژنز  مي باشد.
آندروژنز به دو روش انجام مي شود : الف ـ كشت بساك  ب ـ كشت ميكروسپور  . كشت ميكروسپور اخيراً به لحاظ مزاياي آن بر كشت بساك، مورد توجه قرار گرفته است. در اين روش امكان توليد تعداد زيادي گياهان هاپلوئيد وجود دارد. توليد سريع لاينهاي خالص از ميكروسپورهاي جدا شده، مهمترين ويژگي اين روش در برنامه‌هاي اصلاحي مي باشد. همچنين با توجه به فراواني بالاي توليد گياه از كشت ميكروسپور و نيز سهولت انتقال ژن ، كشت ميكروسپور ، كارآمدترين و بهترين اندام هدف در انتقال ژن به شمار مي آيد و دانشمندان اميدوارند كه در آينده اي نزديك از  اين روش به عنوان يك روش متدوال در مهندسي ژنتيك استفاده نمايند. ميكروسپورهاي گياهان F1 مي توانند لاينهاي دابل هاپلوئيد بسياري توليد كنند تا براي تركيب مطلوبي از صفات گزينش شوند. لاينهاي انتخابي، كاملاً خالص هستند و از نظر يكنواختي و پايداري براي به نژادگران مشكلات كمتري به دنبال دارند .(Mohan Jain et al., 1996)  توليد رويانهاي هاپلوئيد و به دنبال آن توليد گياهان دي هاپلوئيد در كلزا از اهميت ويژه اي برخوردار مي باشد . در طبيعت توليد گياهان هاپلوئيد به صورت خود‎به‎خودي، درگونه‏هاي Brassica در فراواني بسيار  پايين  (حدود 4/19-05/0 در هزار گياه ) اتفاق مي‎افتد ( Banga and Labana , 2003 ) . اما به هر جهت بهره وري واقعي از هاپلوئيدهاي ردهBrassica   با كشف روشهاي القاء رويان از بساكها و ميكروسپورهاي جدا شده در شرايط درون شيشه اي آغاز گرديد . گياهان هاپلوئيد زيادي بطور رايج توسط كشت بساك يا ميكروسپورهاي جدا شده توليد مي شوند، اگرچه تنوع قابل ملاحظه اي بين گونه‎ها ، واريته‎ها و ارقام مختلف وجود دارد ، اما تكنيكهاي كشت ميكروسپور جدا شده و كشت بساك به طور موفقيت‎آميزي براي اكثرگونه‎ها و واريته‎هاي تجاري رده Brassica استفاده شده است و در سالهاي اخير پيشرفتهاي چشمگيري در اين زمينه بدست آمده است ، به طوريكه ‎ رويان زايي ميكروسپور در B. napus يكي از كامل‎ترين سيستم‎ها براي توليد گياه در شرايط درون شيشه اي  است((Burnett  et al., 1992  .
تكنيك باززايي گياه از رويانهاي حاصل از كشت ميكروسپور براي اصلاح نباتات و مهندسي ژنتيك ضروري است اما گزارش شده است كه اكثر رويانها به گياهچه تبديل نمي‌شوند و به صورت غير طبيعي باززايي مي‌شوند يا اينكه رويانهاي ثانوي را تشكيل مي‌دهند. ( Takahata,1997 )   همچنين عدم باززايي يا باززايي بسيار اندك رويانهاي هاپلوئيد به خصوص در كشت پرچم نيز گزارش گرديده است      ( Bruins and Snijder, 1995 ) .  در ايران ، براي اولين مرتبه آزمايشاتي در زمينه رويان زايي و باززايي در قالب پايان‎نامه كارشناسي‎ارشد در دانشكده كشاورزي دانشگاه تربيت مدرس انجام شد ‎‎كه موفقيت چشمگيري نيز حاصل شد. در اولين  تحقيق ( باقري ، 1379 )، سه رقم بهاره  ( F704, Global, Maluka ) وسه رقم پاييزه كلزا  (Ceres  Slmo46, Bounty, ) از لحاظ پاسخ به كشت ميكروسپور مورد ارزيابي قرار گرفتند كه در دو آزمايش هيچ روياني بدست نيامد، اما در آزمايش آخر، از 36 پتري‎ديش كشت شده حدود 20 رويان حاصل شد و رقم Bounty در رويان زايي و  باززايي گياه، به عنوان بهترين ژنوتيپ شناخته شد. در تحقيق ديگر ( خنجي ، 1380 )، پاسخ به كشت ميكروسپورهاي جدا شده كلزا در يك رقم بهاره ( Global ) و دو رقم پاييزه ( Okapi و  Colvert )  مورد بررسي قرار گرفت. رقم Global  به عنوان بهترين رقم در بين ارقام استفاده شده از نظر پاسخ دهي به كشت ميكروسپور كلزا شناخته شد و در هر پتري‎ديش كشت شده، حدود 22% رويان بدست آمد. در تحقيق ديگر ( عبدالهي ، 1381 )، اثر تراکم، اثر شوک حرارتي و اثر تعويض محيط کشت بر روي رويان زايي، واثر اندازه هاي مختلف رويان بر روي باززايي گياه در رقم بهاره کلزا  ( Global ) مطالعه شد. در اين تحقيق، بالاترين ميزان رويان زايي در تراکم 40000 ميكروسپور در هر ميلي‌ليتر محيط كشت بدست آمد. تعويض محيط كشت، ميزان رويان زايي ميكروسپورهای کلزا را در تراكم هاي مختلف ميكروسپور افزايش داد و رويانهاي  ميليمتري، بهترين باززايي را نشان دادند. در تحقيق ديگر ( حبيبي ، 1382 )، اثر حجمهاي مختلف محيط کشت بر روي رويان زايي و اثر شوک حرارتي و زغال فعال بر روي باززايي گياه رقم بهاره کلزا ( PF )  مطالعه شد. در اين تحقيق، بالاترين ميزان رويان ‌زايي در پتري‌ديشهايي با قطر cm 10 و حجمهاي محيط كشت ml 5/12 و ml 10 بدست آمد. همچنين مقايسه ميانگين اثر غلظتهاي مختلف زغال فعال در محيط کشت باززايي بر روي درصد تشكيل گياهچه‌هاي طبيعي نشان ‌داد، كه غلظتهاي مختلف زغال فعال در سطح 5% با هم اختلاف معني‌داري را نشان مي‌دهند، بطوريكه ميزان l-1 g 125/0 زغال فعال با توليد 40% گياهچه كاملاً طبيعي، در گروه a قرار گرفت .  
در اين تحقيق سعي بر اين است تا شرايط براي  باززايي گياهان حاصل از رويانهاي بدست آمده از ميكروسپورها بهينه ‎سازي شود، براي اين منظور اثرات مختلف شوكهاي سرمائي و نيز آبگيري رويانها و اثر استفاده از كاغذ صافي مورد آزمايش و مطالعه قرار گرفت ،  تيمار آبگيري رويانها  با تسريع در بلوغ رويانها ( Wang et al., 2002 ) ، درصد باززايي گياهان را افزايش مي دهند. در ارتباط با مطالعه اثرشوكهاي سرمائي، سرماي هوا نيز مي تواند بر روي تبديل رويان به گياه موثر باشد.
  در هنگام انجام این تحقیق سوالهائی از قبیل سوالات ذیل مطرح بودندکه پاسخ به آنها به تفصیل در قسمت مربوطه آورده شده است .                                                                                                                                          
1- آيا اعمال شوكهاي سرمائي  مي‎تواند اثر معني داري بردرصد باززايي گياهان کلزاي مورد مطالعه داشته باشد ؟
2- آيا استفاده از كاغذ صافي  مي‎تواند اثر معني داري روي درصد باززايي گياهان کلزاي مورد مطالعه داشته باشد؟
3- آيا اثر تراكمهاي مختلف ميكروسپورها بر روي جنين زائي ميكروسپورهاي كلزا اثر معني داري دارد؟
4- آيا باززائي گياه سبز در جنين هائي با اندازه هاي مختلف حاصل از كشت ميكروسپورهاي كلزا با  هم تفاوت معني داري دارند؟


3- 1- مواد گياهي

      ارقام مورد استفاده در اين آزمايش2 رقم گلوبال  وآپشن از تيپهای بهاره ودوصفر می باشند و در چند سال اخير کشت آنها در ايران رایج شده است.

3- 2- كشت بذور

       بذور کلزا در داخل گلدانهايي با قطر  cm25 كشت گرديدند. خاك مورد استفاده شامل دو قسمت خاك معمولي، يك قسمت خاك برگ، يك قسمت كود دامي، يك قسمت ماسه بود. در داخل هر گلدان 5 الي 6 بذر در قسمتهاي مختلف گلدان كشت گرديد و گلدانها پس از كشت بذور در داخل اتاقک رشد گروه اصلاح نباتات سازمان انرژی اتمی بخش كشاورزي هسته ای قرار گرفتند. دو هفته پس از سبز شدن بذور و اطمينان از رشد گياهچه‌ها، در هر گلدان 2 بوته حفظ گرديده و بقيه حذف شدند.

3- 3- شرايط اتاق رشدin vivo

     نور اتاق رشدي كه گلدانها در آن قرار داشتند با 6 لامپ 400 وات بخار سديم تأمين مي شد لامپها در ارتفاع 4/1 متري از سطح گلدانها قرار داشتند و شدت نور در اتاق رشد 30000 لوكس بود. از لحاظ فتوپريودي اتاق رشد روي 8/16 ساعت تاريكي و روشنائی و دماي روز و شب°C10/ °C15 تنظيم شده بود.

3- 4- مراقبت‌هاي زراعي

     مراقبت‌هاي زراعي، شامل آبياري، سم پاشي، محلول پاشي بود. برنامة آبياري هر سه روز يكبار انجام گرفت. از نظر كنترل آفات و بيماريها يكي از آفاتي كه به وفور در فیتوترون ديده ‌شد شته بود كه جهت دفع آنها از ديازينون 2/1 در هزار و متاسيستوكس 1 در هزار استفاده گرديد و برنامة سم پاشي در هر دورة رشد گياهان 2 مرتبه انجام گرفت. يكي از كارهايي كه جهت جلوگيري از شيوع آفات و بيماريها انجام گرفت حذف برگهاي زرد و مرده در قسمت تحتاني گياه بود كه در هر هفته يك بار اين عمل انجام ‌گرفت.به منظور تقويت گياهان مادری از كودهاي مغذي كامل استفاده گرديد كه اين كود به صورت محلول پاشي هر دو هفته يكبار روي برگ گياهان اسپري شد.

3- 5- برداشت غنچه‌ها و تعيين مرحلة مناسب ميكروسپورها جهت جنين‌زايي

      گياهان كلزای بهاره پس از 35 ـ 45 روز از كشت به تدريج شروع به غنچه‌دهي كردند كه به منظور تعيين مرحلة مناسب ميكروسپورها جهت جنين‌زايي، يك آزمايش سيتولوژيكي روي غنچه‌ها انجام گرفت.  بدين ترتيب كه غنچه هايي با اندازه‌هاي مختلف 2-1، 3-2، 4-3، 5-4 و 6-5 ميليمتر از گياهان مختلف به طور تصادفي انتخاب شدند. پس از انتخاب غنچه‌ها با اندازه‌هاي فوق، از هر غنچه يك پرچم با پنس برداشته شد و روي لام قرار داده شد. سپس يك قطره استوكارمن 2% به آن اضافه گرديد و با نوك سوزن پرچم را له كرده و ديواره و قسمتهاي اضافي پرچم حذف گرديد. سپس يك لامل روي آن قرار داده شد. و پس از تهية نمونه از غنچه ها با اندازه هاي مختلف، نمونه‌ها در زير ميكروسكوپ از نظر سيتولوژيكي بررسي شدند و مرحلة ميكروسپور در هر نمونه تعيين گرديد.

3- 6- محيط‌هاي كشت، ايزولاسيون و باززايي در كشت ميكروسپورهای كلزا
3- 6- 1- محيط ايزولاسيون ميكروسپورها

       محيط جداسازي يا استخراج ميكروسپورها ميكروسپورها را از ساير قسمت‌هاي غنچه كه طي آسياب شدن ايجاد مي‌شوند، جدا مي‌كند.محيط استخراج ميكروسپورها در اين آزمايش طبق يک پروتکل کانادايي تهيه گرديد..(Fletcher et al., 1998) براي تهية اين محيط جداسازي g130 ساكاروز در داخل 1 ليتر آب حل گرديد وpH  محلول حاصل روي 6pH= تنظيم گرديد. و پس از تهية آن به مقدارml 150 در هر ارلن توزيع کرده و جهت استريل شدن در اتوكلا و با دماي °C121 و فشار 2/1 بار قرار گرفتند.محيط ايزولاسيون ميكروسپورها پس از اتوكلاو شدن در دماي°C4 ، در داخل يخچال نگهداري شدند.

3- 6- 2- محيط كشت ميكروسپورها

 محيط كشت مورد استفاده در اين آزمايش(Kott., 1998) NLN  مي باشد كه ميكروسپورهاي استخراج شده در اين محيط كشت مي‌گردند. به منظور تهية محيط كشت  NLN- طبق پروتكل از محلولهاي مادري تهيه شده به مقدار مورد نياز برداشته شد و سپس g130 ساكاروز به آن اضافه گرديد و حجم محلول به 1 ليتر رسانده شد ودر نهايتpH  آن روي 6 تنظيم گرديد.

3- 6- 3- استريل كردن محيط كشت ميكروسپورهاي كلزا

      به خاطر حساس بودن بعضي ويتامين‌ها به گرماي اتوكلاو استريل كردن محيط كشت با دستگاه فيلتراستريليزاسيون انجام گرفت. بدين ترتيب كه ابتدا فيلتري با سوراخ‌هايي به قطرµm 22/0 روي دستگاه نصب ‌گردید و سپس دستگاه فيلتراستريليزاسيون در داخل فويل آلومينيم پيچيده شده و در دماي°C121 و فشار 2/1 بار استريل گردید. پس از عبور تمام محيط كشت از فيلتر، در حالي كه دستگاه روشن است درپوش لاستيكي طرف ديگر دستگاه را به آهستگي باز كرده و سپس پمپ خلاء خاموش می گردد. در اين مرحله عمل فيلتراستريليزسيون محيط كشت تمام مي‌شود و محيط كشت داخل مخزن در داخل بطري‌هاي درب آبي استريل شده به ميزانml 200 در هر بطري توزيع مي‌گردد. بطري‌هاي حاوي محيط كشت استريل شده به مدت 3-2 روز در دماي اتاق قرار مي گيرند و پس از اطمينان از استريل بودن آنها در داخل يخچال در دماي °C4نگهداري مي شوند.
 
3- 6- 4- محيط کشت باززايي برای جنين‌هاي حاصل از كشت ميكروسپورهای كلزا

محيط کشت باززايي استفاده شده در اين آزمايش، محيط  حاويmgl-11/0 جيبرليك اسيد (kott et al., 1998) مي باشد. بدين ترتيب كه براي تهيه يك ليتر محيط کشت باززايي  پس از تهية محلولهاي مادري از جمله محلولهاي مادري ماكروالمنت، ميكروالمنت, محلول مادري ويتامين‌ها و محلول مادري  يديد پتاسيم, از هر كدام مطابق پروتكل موجود به مقدار مورد نياز برداشته شد و هورمون اسيد جيبرليك، اضافه گرديده سپس 2% ساكاروز وgl-18 آگار به محيط باززايي اضافه شد.
 در نهايت حجم محلول به 1 ليتر رسانده شد وpH  آن روي 7/5 تنظيم گرديد و در دماي  °C121 و فشار2/1 بار به مدت 20 دقيقه استريل گرديد. پس از استريل كردن، محيط کشت باززايي در زير لامنيارايرفلو در شرايط كاملاً استريل در پتري ديش‌هاي شيشه اي به ابعاد mm 15×100 توزيع گرديد و تا زمان انتقال جنين‌ها، پتري ديش‌ها در داخل پلاستيک محافظ غذا پيچيده شدند و در داخل يخچال نگهداري شدند.



جدول 3-1- مواد مورد نياز جهت تهية يك ليتر محيط كشتNLN-  و محيط باززايي

اجزاء     1 NLN-             

Macroelement        
           

NO3   
MnSO4.7H2O
Ca(NO3) 2.4H2O
KH2PO4
CaCl2
(NH4) 2SO4
NaH2PO4.H2 O    125
125
500
125
-
-
-    2500
250
ـ
ـ
150
134
150
Microelement        
MnSO4.4H2O
Boric acid      
ZnSO4.7H2O
    Na2MoO4.2H2O
CuSO4.5H2O
CoCl2.6H2O
KI                   30/22
2/6
6/8
25/0
025/0
025/0
ـ    10
3
2
25/0
25/0
25/0
75/0




        
        
Vitamin        
Biotin
Folic Acid
Glycine
Nicotinic acid
Pyridoxine.HCl
Thiamine.HCl
Glutathion
L-Glutamine
L-Serin    05/0
5/0
2
5
5/0
5/0
30
800
100    -
ـ
-
1
1
10
ـ
ـ
ـ
Myo-inositol    100    100
Agar    ـ    8000
Sucrose    130000    20000
pH*    6    7/5
Fe.EDTA      X     ml
Na2.EDTA
FeSO4.7H2O    2/149
2/111    

* pH با استفاده از NaOH وHCl  يک نرمال تنظيم گرديد.

* اسيد فوليك در آب حل نميشود. بنابراين ml 100 محلول مادري بي‌كربنات سديم 1/0 نرمال تهيه گرديد و سپس 5 ميلي‌گرم اسيد فوليك در داخلml  5 از اين محلول، حل گرديد و سپس اين 5 ميلي‌ليتر به محيط كشت اضافه شد.







3- 6- 5- وسايل مورد نياز جهت كشت ميكروسپورهای كلزا

وسايل مورد نياز براي كشت ميكروسپور عبارتند از: پيپت‌هاي شيشه‌اي، كاپ ميكروبلندر، الک هاي آزمايشگاهي با سوراخهايي به قطر  µm100 و  µm40 ، لوله‌هاي شيشه‌اي مخصوص سانتريفيوژ، پتري ديش‌هاي شيشه‌اي به ابعاد  mm20×120، شيشه‌هاي درب‌دار حاوي آب مقطر استريل كه ظروف مذکور توسط اتوكلاو در درجه حرارت °C121 و فشار 2/1 بار به مدت 20 دقيقه استريل شدند. در ضمن 20دقیقه قبل از كشت بهتر است كه دستگاه لامينار روشن گردد و همچنين قبل از شروع کار سطوح داخلي لامينار با پنبة آغشته به الكل 70% ضد عفوني  مي گردد.

3- 7- روش انجام آزمايش كشت ميكروسپورهای كلزا
3- 7- 1- برداشت غنچه‌ها

     ابتدا 100 غنچه‌ 4ـ3 ميلي‌متري كه حاوي ميكروسپورهاي جنين‌زا بودند از گياهان كشت شده در داخل اتاق رشد انتخاب گرديده و در يك ظرف كوچك فلاسک مانند كه در ديوارة آن يك لايه يخ وجود داشت ريخته شدند.

3- 7- 2- استريل كردن غنچه‌ها

      در زير لامينار غنچه‌ها در داخل يك ظرف سبد مانند به حجم تقريبا ً ml40-30 ريخته شدند و پس از بستن درب ظرف، در داخل يك ظرف شيشه‌اي درب‌دار حاوي هيپوكلريت سديم25/5% ( گلرنگ ) به مدت 10 دقيقه قرار گرفت. كه در طول اين 10 دقيقه ظرف حاوي غنچه ها چندين بار تكان داده شد تا هيپوكلريت سديم با تمام غنچه‌ها تماس پيدا كند. پس از ضد عفوني كردن غنچه‌ها با هيپوكلريت سديم، ظرف پلاستيكي سبد مانند حاوي غنچه ها با پنس استريل بيرون آورده شد و در داخل ظروف شيشه اي حاوي آب مقطر استريل قرار گرفت. در مجموع شستشوي غنچه‌ها با آب مقطر استريل 2 مرتبه و هر مرتبه 5 دقيقه انجام گرفت. لازم به يادآوري است كه ظروف حاوي هيپوكلريت سديم و آب مقطر تا قبل از شروع ضد عفوني غنچه‌ها در يخچال در دماي °C4-2 قرار نگهداري مي شدند.

3-7- 3- استخراج ميكروسپورها

     غنچه‌هاي استريل شده توسط پنس استريل به داخل كاپ ميكروبلندر منتقل شدند. (كاپ ميكروبلندر تا 20 دقيقه قبل از شروع آزمايش در فريزر يخچال در دماي صفر درجة سانتي‌گراد نگهداري مي شد). پس از انتقال غنچه‌ها به كاپ ميكروبلندر ml 30 محيط استخراج ميكروسپورها به داخل كاپ اضافه گرديد. و سپس كاپ بر روي دستگاه آسياب نصب گرديد. غنچه‌ها طي 3 مرتبة 10 ثانيه‌اي آسياب شدند. سوسپانسيون حاصل از آسياب كردن غنچه‌ها در شرايط كاملاً استريل به ترتيب از دو الك آزمايشگاهي با سوراخهايي به قطر 106 و 53 ميكرومتر كه بر روي هم قرار داشتند, عبور داده شد. سپس با استفاده از  ml20 ديگر از محلول استخراج ميكروسپورها جداره‌هاي كاپ ميكروبلندر و تيغ آن كه آغشته به غنچه‌هاي آسياب شده بود شستشو گرديد. پس از عبور سوسپانسيون ميكروسپورها از الكهاي آزمايشگاهي و قرار گرفتن در يك ظرف استريل، سوسپانسيون حاصل توسط پيپت استريل به داخل لوله هاي شيشه‌اي مخصوص سانتريفيوژ ( هر لوله ml 30 - 25) توزيع گرديد. سپس ظروف فوق به داخل رکهاي سانتريفيوژ منتقل شدند و رکها در داخل دستگاه سانتريفيوژ قرار گرفتند. لازم به يادآوري است كه رکهاي سانتريفيوژ بايد قبل از انجام سانتريفيوژ از لحاظ وزني كاملاً هم وزن باشند تا تعادل آنها در هنگام سانتريفيوژ حفظ گردد.
دستگاه روي rpm1500 به مدت 4-5دقیقه سانتريفيوژشدند. پس از اتمام 4 دقيقة اول سانتريفيوژ، لوله هاي سانتريفيوژ از دستگاه خارج گرديدند. پس از سانتريفيوژ يك لاية رسوب زرد رنگ در ته لوله هاي شيشه‌اي قرار داشت و در بالاي آن مايع سبز رنگي وجود داشت. مايع فوقاني سبز رنگ روي رسوب ميكروسپورها بایک پيپت استريل حذف گرديد و  ml25 محلول تازة جداسازي ميكروسپور اضافه گرديد و عمل سانتريفيوژ 4 دقيقة ديگر به همان ترتيب گفته شده انجام گرفت كه در اين مرتبه مايع فوقاني بالاي رسوب ميكروسپور شفافتر گرديد. که اين عمل تا شفاف شدن محلول روئی ادامه می یابد.

3- 7- 4- تعيين تراكم ميكروسپور
 
      پس از حذف مايع فوقاني بالاي ميكروسپورها دردومين سانتريفوژ،  ml5-4محيط كشت  NLN-13 به رسوب ميكروسپورها اضافه گرديد و چند بار به هم زده شد تا سوسپانسيون حاصل كاملاً يكنواخت گردد. سپس با استفاده از ميكروپيپت يك قطره از سوسپانسيون حاصل در دو جايگاه سلولي دو طرف لام شمارش سلول قرار گرفت. در دو طرف لام دو جايگاه شمارش سلول وجود دارد كه در لام هموسیتومتردرهر جايگاه از تقاطع يك سري خطوط عمود بر هم 4 مربع به وجود آمده است كه هر كدام از اين 4 مربع خود از 16 مربع کوچکتر ديگر تشكيل شده‌اند. تعداد ميكروسپورهايي كه در اين 4 مربع وجود داشت در هر جايگاه شمارش سلولي شمرده شد و ميانگين تعداد ميكروسپورها در دو جايگاه سلولي براي تعيين حجم جديد محيط كشت بر اساس تراكم دلخواه در فرمول زير قرار گرفت.
B/C = D * 10000 *                                               A
A = ميانگين تعداد ميكروسپورهاي شمرده شده در دو جايگاه شمارش سلولي لام شمارش
B = حجم نمونه اي که از سوسپانسيون ميکروسپورها جهت شمارش ميكروسپور برداشته مي شود.
C = تراكم مورد نياز
D = حجم جديد محيط كشت
پس از تعيين تراكم ميكروسپور مورد نياز, سوسپانسيون حاوي ميكروسپورها, به حجم جديد رسانده شد و سوسپانسيون حاصل در داخل پتري ديش‌هاي شيشه‌اي بزرگ به ابعاد  mm20×120 به مقدار  ml15 در هر پتري ديش توزيع گرديد و دور هر پتري ديش دو لايه پارا فيلم بسته شد. سپس مشخصات تيمار اعمال شده و تاريخ كشت ميكروسپور روي پتري ديش‌ها يادداشت گرديد و پتري ديش‌ها در داخل انكوباتور در تاريكي جهت اعمال تيمار حرارتي مورد نظر قرار گرفتند.




پایان نامه

برای دیدن ادامه مطلب از لینک زیر استفاده نمایید

سفارش پایان نامه