انجام پایان نامه

درخواست همکاری انجام پایان نامه  بانک مقالات رایگان انجام پایان نامه

سفارش پایان نامه

|

انجام پایان نامه ارشد

 پایان نامه 

انجام پایان نامه ارشد|پايان نامه زراعت 90 ص


روش هاي سترون سازي :
اهميت موضوع رعايت شرايط استريل در طي انجام کشت بافت هاي گياهي به قدري واضح است که تاکيد بر آن توضيح واضحات است.
با رعايت چند مورد احتياطي ساده مي توان ضمن جلوگيري از آلودگي ميکروبي محيط از هدر رفتن اوقات پر ارزش مصرف شده در آزمايشگاه به منظور تکرار کشت هاي آلوده شده ممانعت به عمل آورد.
در انتخاب محل اتاق کار سترون مهم ترين موضوع منحصر به فردي که بايد دقيقا مورد توجه قرار گرفته شده باشد جلوگيري از جريان يافتن هواي معمولي بر روي محل کار استريل شده مي باشد , زيرا جريان هوا با انتقال دادن اسپورها و ارگانيسم هاي آلوده کننده به اتاق کار سبب ايجاد آلودگي در کشتها مي شود. اختصاص دادن يک اتاق کوچک اندروني, اتاقي شبيه تاريکخانه عکاسي, به عنوان اتاق کار سترون شده روش بسيار مطلوبي است.
در اين قبيل اتاقکها معمولا به منظور انهدام اجرام ميکروبي موجود در هوا و سترون کردن سطوح داخلي اتاقک لامپ ميکروب کش توليد کننده اشعه ماورا بنفش نصب مي شود. اشعه اين لامپ ها (که طول موج آن 253.7 نانومتر است) اجرام ميکروبي را به آهستگي منهدم مي کند, ولي بدليل عدم نفوذ تشعشعات اين لامپ ها به قسمت هاي عمقي و قسمت هاي گرد گرفته و سايه گير اتاقک کار اجرام ميکروبي اين قسمتها از گزند اين اشعه مصون مي مانند. بهمين دليل اگر چه استعمال اين لامپ در اتاقک هاي کار کاملا مرسوم است, ولي تاثير قطعي آن در ايجاد محيط کاملا عاري از ميکروب مورد شک و ترديد مي باشد (18, و 11). عمر لامپ هاي ما وراء بنفش نسبتا کوتاه است . البته پس از متوقف شدن تولي اشعه ما وراء بنفش در طول موج 253.7 نانومتر اين لامپ ها براي مدتي به توليد نور مرئي ادامه مي دهند. در صورت وجود ابزار پلاستيکي در اتاقک کار از روشن کردن لامپ اشعه ما وراء بنفش خودداري نمود. ضمنا ادعا شده است که اين لامپ ها ممکن است باعث توليد شدن مواد بازدارنده رشد در مديوم کشت شوند. خلاصه اينکه استفاده از اين گونه لامپ هاي ميکروب کش بايد بحداقل ممکن کاهش داده شده و نبايد بسهولت جايگزين ساير روشهاي سترون سازي شوند. کابينت هاي روميزي مجهز به جريان هواي سترون شده بنحوي طراحي شده اند که در آنها جريان ملايمي از هواي الترافيلتره و سترون شده بطور مداوم از روي ميز کار عبور داده مي شود تا ميزان تماس هواي معمولي آلوده به اجرام ميکروبي با مواد و ابزار کشت بحداقل مقدار ممکن کاهش داده شود. به هنگام روشن کردن چراغ الکلي در داخل اين قبيل کابينت ها بايد موارد احتياط رعايت شوند, زيرا که الکل به شدت آتش گير است و جريان هواي داخل کابينت ممکن است شعله هاي آتش را به سمت محقق هدايت کند. ضمنا در حين انجام کشت پس از فرو برده شدن ابزار کار به داخل شيشه محتوي الکل اتانول يا الکل ايزوپروپانول 80 درجه ابتدا بايد با استفاده از کاغذ صافي استريل الکل اضافي آنها گرفته شده و سپس آنها برروي شعله چراغ الکلي گرفته شوند. قبل از شروع عمليات سترون نياز ميز کار بايد با حوله کاغذي آغشته به الکل اتانول و يا الکل ايزوپروپانول 80 درجه ضدعفوني شود. يکي ديگر از مسائل مبتلا به فعاليت هاي سترون نياز و عمده ترين منبع آلودگي کشتها کثيف بودن دستهاي محقق است. براي انجام دادن عمليات سترون نياز شستشوي معمولي دستها با آب کافي نيست , بلکه ضروري است دستها تا آرنج بشدت و به مدت چندين دقيقه با آب گرم فراوان و صابون شستشو داده شوند. دستها را پس از شستشو و خشک کردن بايد با محلول خيلي رقيق الکل اتانول يا الکل ايزوپروپانول ضدعفوني نمود.
به منظور سترون سازي ظروف شيشه اي مورد مصرف, ابزار کار, محلولهاي غذايي, و مواد گياهي مي توان از روشهاي متعددي مانند: حرارت خشک, حرارت مرطوب (بخار داغ), الترافيلتراسيون, و سترون سازي شيميايي استفاده نمود.

روش حرارت خشک (آون) Dry heat     :
اين روش براي ضدعفوني کردن ظروف شيشه اي, ابزار فلزي, و ساير وسايل و موادي که در حرارت هاي بالا خراب نمي شوند(نمي سوزند) استفاده مي شود. البته وسايلي را که در ساختمان آنها پنبه, کاغذ, و يا پلاستيک بکار رفته باشد نميتوان با حرارت خشک ضدعفوني نمود. تيغ و چاقوهاي جراحي و اسکالپل ها نيز نبايد با اين روش استريليزه شوند, زيرا حرارت هاي بالا موجب کند شدن لبه برنده اين وسايل ميشود. اگرچه در ضدعفوني کردن وسايل با حرارت توصيه ميشود که از آون هاي آزمايشگاهي استفاده شود,ولي مي توان از کوره (فر) اجاق گاز و يا اجاق برقي خانگي نيز بهمين منظور استفاده نمود.
استريليزاسيون با آون شامل سه مرحله مهم مي باشد :
1-    مرحله اول شامل زمان لازم براي گرم شدن کوره مي باشد. براي گرم شدن کوره و رسيدن دماي محتويات آن به دماي استريليزاسيون در همه قسمت ها مدت تقريبا يکساعت مورد نياز است.
2-    مرحله دوم عبارت است از زمان لازم براي استريليزاسيون. زمان لازم براي استريليزاسيون بر حسب دماي کوره متغير است و عبارت است از 45 دقيقه در 160 درجه سانتيگراد, 18 دقيقه در 170 درجه  سانتيگراد, 5/7 دقيقه در 180 درجه  سانتيگراد, و 5/1 دقيقه در 190 درجه  سانتيگراد .اگر دماي کوره حرارتي در يک درجه متعادل مثلا در 160 درجه سانتيگراد تنظيم شده باشد زمان لازم براي اجراي استريليزاسيون (مجموع سه مرحله) تقريبا دو ساعت خواهد بود .
3-    مرحله سوم عبارت است از زمان لازم براي خنک شدن کوره مي باشد.
 توصيه مي شود که بمنظور جلوگيري از ترک برداشتن ظروف شيشه اي, در اثر کاهش ناگهاني درجه حرارت, پس از اتمام استريليزاسيون و قبل از بيرون آوردن ظروف از داخل کوره مدتي هم براي خنک شدن آنها اختصاص داده شود. قبل از قرار داده شدن وسايلي که قرار است در کوره حرارتي استريليزه شوند بايد آنها به دقت با ورق آلومينيومي مقاوم پيچيده شوند. در کشور امريکا سه نوع ورق آلومينيومي بصورت تجاري عرضه مي شوند که عبارتند از : ورق آلومينيومي نازک, مقاوم, و خيلي مقاوم. در تحقيقات مربوط به کشت بافت هاي گياهي هميشه از نوع مقاوم استفاده ميشود, زيرا در نوع نازک اکثرا سوراخهاي بسيار ريزي وجود دارد و نوع خيلي مقاوم نيز براي پيچيدن شيشه آلات بيش از حد ضخيم است. پس از اتمام عمل سترون سازي ابزار استريليزه شده, که هنوز در ورق آلومينيومي پيچيده هستند, به اتاقک کار منتقل ميشوند.
روش حرارت مرطوب ( بخار داغ ) Wet Heat     :
در اين روش از اتوکلاوهايي که قادر به توليد بخار داغ تحت فشار هستند استفاده ميشود . اگر در آزمايشگاه اتوکلاو وجود نداشته باشد ميتوان بجاي آن از يک ديگ بخار و يا ديگ زود پز تحت فشار استفاده نمود. بمنظور استريليزه کردن مواد کاغذي, ظروف شيشه اي, ساير ابزار کار, و ارلن هاي محتوي مايع (بشرطي که در هر ظرف شيشه اي کمتر از 50 سانتيمتر مکعب مايع وجود داشته باشد) فشار بخاري معادل 15 پوند بر اينچ مربع (4/103) در دماي 121 درجه سانتيگراد بمدت 15 دقيقه مورد نياز ميباشد.  اگر در آزمايشگاه اتوکلاو وجود نداشته باشد ميتوان بجاي آن از يک ديگ بخار و يا ديگ زود پز تحت فشار استفاده نمود. بمنظور استريليزه کردن مواد کاغذي, ظروف شيشه اي, ساير ابزار کار, و ارلن هاي محتوي مايع (بشرطي که در هر ظرف شيشه اي کمتر از 50 سانتيمتر مکعب مايع وجود داشته باشد) فشار بخاري معادل 15 پوند بر اينچ مربع (4/103) در دماي 121 درجه سانتيگراد بمدت 15 دقيقه مورد نياز ميباشد.  با افزايش حجم مايعات موجود در ظروف شيشه اي حداقل زمان لازم براي استريليزاسيون نيز افزايش مي يابد.
زمان شروع استريليزاسيون بايد از لحظه اي حساب شود که دماي اتوکلاو و يا ديگ زود پز تحت فشار به دماي تعيين شده رسيده و تمامي هواي موجود در اتوکلاو و يا ديگ زود پز نيز بيرون رفته و جاي آنرا بخار داغ پر کرده باشد. اگر از زود پز تحت فشار استفاده ميشود تا زماني که بخار خالص و مداوم از آن خارج نمي شود نبايد دريچه تخليه بخار را مسدود نمود. در خاتمه زمان استريليزاسيون ,فشار داخل اتوکلاو بايد بتدريج کاهش داده شده و به حد فشار معمولي رسانده شود, زيرا کاهش سريع و ناگهاني فشار به بيرون ريخته شدن مايعات جوشان موجود در داخل ظروف شيشه اي منجر خواهد شد. بايد از طولاني تر شدن بيش از حد زمان استريليزاسيون اجتناب شود, زيرا اين عمل ممکن است باعث تجزيه شدن مواد شيميايي موجود در مديوم گردد .
پس از اتوکلاو کردن هر گونه جسم کاغذي, جسم مزبور بايد به مدت کوتاهي در کوره خشک با حرارت کمتر از 60 درجه سانتيگراد قرار داده شود تا اينکه رطوبت باقي مانده آن تبخير شود. در طول استريليزاسيون بخار داغ بايد بتواند بداخل مواد نفوذ نمايد , زيرا دماي121 درجه سانتيگراد في نفسه قادر به سترون سازي کامل مواد نيست.
به استثناي ارلن ماير ها ساير ابزار و وسايل بايد قبل از قرار داده شدن در اتوکلاو در داخل پاکت هاي کاغذي موم اندود شده اي گذاشته شوند. اگر چه در اکثر موارد از ورق آلومينيومي براي پيچيدن ظروف شيشه اي و غيره استفاده مي شود ولي چون ورق  آلومينيومي نسبت به بخار آب نفوذ ناپذير است لذا استعمال آن در روش اتوکلاو توصيه نمي شود. در ديگ اتوکلاوهايي که راساً بخار داغ توليد مي کنند و نيز در زود پز هاي تحت فشار بايستي از آب خالص که قبلا مواد معدني آن گرفته شده است استفاده شود. بخار داغ توليد شده توسط موتور خانه خارجي سيستم هاي حرارت مرکزي معمولا بمواد فرار متعددي آلوده مي باشد که اين مواد فرار ممکن است توسط وسايل و مواد تحت استريل در اتوکلاو جذب شوند .در اتوکلاو کردن ابزار آزمايشگاهي پلاستيکي بايد احتياط کافي رعايت شود .
يکي ديگر از روش هاي سترون سازي با حرارت مرطوب استفاده از حمام آب جوشان Boiling water bath   است. بدين ترتيب که مواد مورد نظر بمدت 20 دقيقه در داخل آب جوشان محتوي کربنات سديم ( به نسبت 3 درصد ) قرار داده مي شوند . در اين روش تمامي قسمت هاي رويشي ميکروارگانيسم ها منهدم ميشوند ولي ممکن است برخي از اسپورهاي خيلي مقاوم زنده بمانند .
روش الترافيلتراسيون  Ulterafilteration      :
بدليل نا پايدار بودن برخي از اجزاي مديوم غذايي در درجه حرارت بالا, براي سترون سازي اين مواد بايد از روش الترافيلتراسيون در دماي معمولي استفاده شود. اصولا در تهيه مديوم هاي کشت مقادير کمي از اين مواد مورد نياز مي باشد. اين مواد را ميتوان با عبور دادن از يک سيستم صافي غشايي سوار شده بر روي يک سرنگ مدرج استريليزه نمود.
پس از استريل کردن اين گونه مواد با روش فوق حجم مورد نياز مايع استريل شده مستقيما برروي مديوم اتوکلاو شده افزوده مي شود. در صورت استفاده از مديوم آگار پايه ماده الترافيلتر شده بايد در حالي که هنوز آگار گرم بوده و در وضعيت مذاب مي باشد بر روي آن اضافه شود. اگر الترافيلتراسيون حجم زيادي از يک ماده مورد نياز باشد بايد از دستگاه ديگري که مجهز به يک وسيله نگهدارنده فيلتر است استفاده شود. دستگاه فوق الذکر به سيستم ايجاد خلا و يا فشار مجهز مي باشد.
صافي هاي غشايي اکثرا با مواد فعال کننده سطحي محلول در آب اشباع مي شوند. در برخي موارد مشاهده شده که آزاد شدن موادي از اين قبيل صافي ها در طول فيلتراسيون برروي رشد سلول هاي کشت شده تاثير منفي مي گذارد, لذا توصيه ميشود که قبل از استعمال اين گونه فيلترها با استفاده از آب گرم سترون شده مواد فعال کننده سطحي از روي فيلترها زدوده شوند. بدين منظور از تقريبا 200 سانتيمتر مکعب آب مقطر استريل شده 90-100 درجه سانتيگراد استفاده مي شود.
پس از انجام اين عمل بايستي آب مقطر صاف شده را به دور ريخته و يک ارلن استريل ديگري بر روي دستگاه فيلتراسيون سوار نموده و سپس دستگاه را در يخچال خنک مي شود. اگر عمل الترافيلتراسيون در دماي پايين تر انجام داده شود مقدار کمتري از مواد فعال کننده صافي غشائي به مواد صاف شده ترشح خواهد شد.
روش استريليزاسيون شيميايي  :
معمولا سطح ميز کار در داخل اتاقک کار بايد توسط الکل اتانول يا الکل ايزوپروپانول 70 درجه ضدعفوني شود. اگرچه ممکن است الکل اسيدي شده (2=PH) 70 درجه ماده ضدعفوني کننده موثرتري باشد, ولي به دليل خاصيت خورندگي که بر روي ابزار فلزي دارد استفاده از آن زياد رايج نيست. به منظور ضدعفوني کردن ابزار فلزي در حين کار از الکل اتانول 80 درجه, که خاصيت اشتعال بيشتري دارد, استفاده ميشود. بدين منظور الکل اتانول 80 درجه را در يک لوله آزمايش بزرگ (25 در 150 ميليمتر) پر کرده و لوله را در داخل يک ظرف استوانه اي فلزي خالي قرار مي دهند. در موقع کار ابزار فلزي در لوله محتوي الکل فرو برده شده و سپس به مدت چند لحظه در روي چراغ الکلي متانول گرفته مي شود. البته پس از بخار شدن الکل ابزار فلزي بايد از حرارت دادن بيش از حد آنها اجتناب شود. پس از پايان کار بمنظور جلوگيري از تبخير الکل بايد دهانه لوله محتوي الکل مسدود گردد.
سطوح خارجي مواد گياهي را مي توان با استفاده از محلول رقيق هيپوکلريت سديم (CLo Na)  و يا هيپوکلريت کلسيم (Ca 2(CLo) استرليزه نمود. در اکثر آزمايشگاهها براي اين منظور از مواد سفيد کننده معمولي مانند کلراکس استفاده مي کنند.
در اين فراورده تجاري معمولا به نسبت 25/5 درصد هيپوکلريت سديم فعال وجود دارد. به منظور انجام ضدعفوني, يک قسمت از کلراکس تجاري را با 9 قسمت آب رقيق مي کنند تا محلول رقيق 5/0 درصد کلريت سديم تهيه شود.
به دليل تجزيه کامل هيپوکلريت سديم در محيط هاي قليايي اين ترکيب در PH بالاتر از 8 فعاليت کمتري از خود نشان ميدهد. لذا اگر PH محلول به 6 تقليل داده شود تاثير آن بمقدار قابل توجهي افزايش خواهد يافت. اگر بافت گياهي تازه تهيه شده و بطور کامل در داخل محلول هيپوکلريت فرو برده شود تقريبا پس از مدت 10 دقيقه سطوح خارجي بافت گياهي استرليزه مي شود. سپس بافت گياهي را که از داخل محلول رقيق هيپوکلريت بيرون آورده شده بايستي چندين بار در داخل بشرهاي محتوي آب مقطر شستشو داد تا بقاياي هيپوکلريت کاملا زدوده شود. قطعات گياهي نسبتا درشت بايستي حداقل در داخل سه بشر 600 سانتيمتر مکعبي که هر کدام محتوي تقريبا 200 سانتيمتر مکعب آب مقطر هستند بطور متوالي شستشو داده شوند. نظر به اثرات خورندگي, محلول هيپوکلريت و بشرهاي محتوي آب مقطر بايد بخارج از اتاقک کار منتقل شده و بدور ريخته شوند.



انجام پایان نامه

برای دیدن ادامه مطلب از لینک زیر استفاده نمایید

سفارش پایان نامه