انجام پایان نامه

درخواست همکاری انجام پایان نامه  بانک مقالات رایگان انجام پایان نامه

سفارش پایان نامه

|

انجام پایان نامه ارشد

 پایان نامه 

سفارش پایان نامه|بيوتكنولوژي انتقال ژن در ماهي


: دست كاريهاي ژني در ماهيان
مقدمه:
يكي از زمينه هاي كه امروزه بيوتكنولوژيست ها روي آن تحقيق مي كنند ايجاد گونه هاي ترانسژنيك است. طبق تعريف ترانسژنيك موجودي است كه، داراي DNA  نو تركيبي باشد. به طوري كه در ژنوم آن موجود ژن نو تركيب بيان مي شود. بيان ژن خارجي يكي از جنبه هاي توليد ترانسژنيك و انتقال DNA به زاده هاي  هدف بعدي مي باشد. در اين زمينه تكنيك ميكرواينجكش در انتقال ژن به تخم مهره داران اولين بار به وسيله گوردون (Gordon) و همكاران در سال 1980 گزارش شد. در اين تكنيك يك لوله مؤئين شيشه اي را براي وارد كردن DNA نو تركيب به پيش هسته نريا با سيتوپلاسم تخم لقاح يافته موش به كار گرفتند. در همين سال ميكروانجكش مستقيم DNA نو تركيب در شرايط آزمايشگاهي جهت ايجاد حيوانات ترانسژنيك مورد استفاده قرار گرفته است. طوري كه ژن را از اين طريق وارد تخم هاي لقاح نيافته يا لقاح يافته موجوداتي نظير جنين توتياي دريايي،‌ موش،‌ قورباغه، مگس سركه، خرگوش و خوك كرده اند (Brem 1988) در سال 1985 زئو (Zhu) و همكاران ژني شامل پرتومتالوتيونين موش و ژن هورمون رشد انساني را به ناحيه مركزي صفحه زاياي تخم هاي لقاح يافته ماهي طلايي تزريق كردند و قسمتي از اين ژن را در DNA ماهيان مشاهده كرند. در همين سال روكونس (Rokkones) تكنيك ميكرواينجكشن دو مرحله اي بر روي تخم آزاد ماهيان را شرح داده است. در اين تكنيك ابتدا به كمك يك وسيله نوك تيز فلزي در قطب حيواني سوراخي ايجاد شده و از طريق اين سوراخ محلول حاوي DNA  نو تركيب به كمك پي پت ريز تخم شدند به طوري كه به كيسه زرده وارد نشوند. پس از 14 روز پلاسميدهاي كامل را مشخص كردند. چوروت (Chourrout) و همكاران در سال 1986 روش فوق را بر روي قزل آلاي قهوه اي رنگ به كار برند با توجه به وجود DNA خارجي همراه با ملكولهاي DNA ميزبان پيشنهاد شده كه اين ژن به داخل ژنوم ماهي وارد شده است. محققان به ورش دستي يا از طريق هضم آنزيمي از  جمله با تريپسن كوريون را برداشته و تزريق ميكرواينجكشن انجام دادند. در همين سال اوزاتا (Ozata) ماهي كوچك مدوكا را به عنوان مدلي براي ترانسژنيك مطرح كرد. او پلاسميدهاي حاوي ژن كريستالين جوجه را به هسته تخم ها از طريق ميكرواينجكشن وارد كرد. به علت كوريون سفت در تخم لقاح يافته تعدادي از ماهيان استفاده از ميكرواينجكشن مشكل و مستلزم اتلاف وقت زيادي است. به همين منظور  روشهايي جهت غلبه بر اين مشكل به كار گرفته شده است. از جمله در سال 1988 بريم (Brem)  و همكاران ژن هورمون رشد انسان را به كمك وكتور مناسب از طريق ميكروپيل به صفحه زاياي تخم هاي تيلاپيا تزريق كردند و رشد بچه ماهيان طي 90 روز بررسي شد. مشابه اين تحقيق توسط فلت چر (Fletcher) و همكاران در همين سال بر روي ماهي آزاد اتلانتيك انجام شد. همچنين تكنيكهاي ديگر شامل الكتروپورشن (Electroporation) شليك ذرات ژن Shatagun بر روي تخمك و طراحي ليپوزوم جهت ورود به زرده تخم انجام شده است. ميكر واينجكشن نياز به مهارت زيادي دارد و از طرفي سرعت آن كم و هزينه و تجهيزات آن زياد است و مستلزم زحمات و زمان زيادي براي ايجاد تعداد زيادي از ما هيان ترانسژنيك است علاوه بر اين از ديگر مشكلات آن اين است كه در تخم هاي القاح يافته اغلب ماهيان هسته به وسيله ميكرسكوپ قابل روئيت نيست بنابراين DNA را به سيتو پلاسم  تزريق مي كنند.
در مجموعه تحقيقات انجام شده، ميزان باقي ماندگي جنين هايي كه مورد تزريق قرار گرفته اند بين 50 تا 80 درصد گزارش شده است. و كارآيي ميزان بيان ژن بين 3 تا 70 درصد بوده است. باقي ماندگي جنين ها و كارايي بيان ژن وابسته به فاكتورهايي نظير سيستم بافري، غلظت DNA  و روش هاي مورد استفاده در تزريق مي باشد. لذا در مراحل بعدي غلبه بر اين مشكلات مورد توجه قرار گرفت به طوري كه ضمن ساده كردن تكنك و كم كردن هزينه ها كارآيي را افزايش مي دهند تا در عمل بتوان در تكنولوژي تكثير و پرورش آبزيان تعداد زيادي از ماهيان ترانسژنيك را ايجاد كرد. بنابراين روش استفاده از اسپرم جهت انتقال ژن مطرح شد. اگر چه مفهوم بكارگيري اسپرم به عنوان يك ناقل مسئله جديدي نيست بلكه در سال 1971 براكت (Brackett) با وارد كردن ژن خارجي به اسپرم خرگوش و در سال 1987 فريمن (Fareeman) بر روي ماكيان اين تحقيق را انجام داده اند و در سال 1989 لويترانو (Lavitrano) اين تكنيك را بر روي موش به كار گرفته است. در سال 1992 كهو (Khoo) تكنيك استفاده از اسپرم به عنوان ناقل را جهت وارد كردن ژنهاي جديد به ماهي زبر به كار گرفت. همچنين در سال 1993 ايكسي (Xie) و همكاران جزئيات انتقال ژن از طريق اسپرم به كمك التروپورشن (Electroporation) بر روي ماهيان لوچ (Loach) و كاراس (Crucian) را شرح داده اند. در همان سال (سين) Sin و همكاران انتقال ژن به ماهي چنوك (Chinook) را با همين تكنيك شرح دادند. در  اين نوشتار جزئيات دستكاريهاي ژني در ماهيان با ذكر مثالهايي بررسي شده است.
1-1- به كار گيري پروموتر از ژن ماهيان
گزارشهاي اندكي در ارتباط با تحقيقات به كارگيري پروموتر از ماهي در دسترس است. در ماهي قزل آلاي رنگين كمان دو فرم مشابه از ژنهاي متالوتيونين بنام B,A وجود دارد. اگر چه پروموترژن B قادر به بيان  ژن  گزارشگر در محيطهاي  كشت سلولي  است. ولي درباره اين ويژگي پروموترژن B در سلولهاي ماهي اطلاعات كمي وجود دارد. به منظور طراحي و كتورهاي مناسب براي ما هي و مطالعه تنظيم بيان ژن در داخل بدن و شرايط آزمايشگاهي پروموترن ژن B متالوتيونين  ماهي قزل آلا جدا شد. پس از PCR نقش آن در بيان ژن در لاينهاي سلولي انسان و ماهي توسط هونگ (Hong) به كار گرفته شد. به همين منظور وكتور بنام PtMTb – CAT كه داراي 6/4 كيلوباز است طراحي گرديد. حدود 261 حفت باز وكتور مربوط به پروموترژن B متالتيونين قزل آلاي رنگين كمان (tMTb) كيلو باز آن ژن كلرامفنيكل استيل ترانسفراز (CAT) و سيگنال پلي ادنيلاسيون ويروس SV40 و همچنين 7/2 كيلو باز آن قطعه اي مربوط به پلاسميد PUC18 بوده است همچنين طراحي آن بر پايه ساختمان pBL – CAT تكميل شده بود. به طوري كه طراحي BL پرايمري داراي سكانس اوليگونكلئوتيدي بر اساس رديف نكلئوتيدهاي سمت 5 از 250 تا 221 ژن MTb ماهي قزل آلا بوده و داراي محل ويژه اي جهت برش توسط آنزيم EcoRI بوده است. همچنين در ساختمان پلاسميد ptMTb – CAT قطعه 261 جفت بازي پروموتر tMTb در جلوي ژن CAT در ساختمان  CAT pBL- قرار گرفته است. در كنار اين چهار وكتور ديگر طراحي گرديد، كه شامل pBL-CAT2-1 كه در آن پروموتر تيميدين كيناز (TK) ويروسي در بالا دست ژن CAT قرار داده شده بود. pBL-CAT3-2 بر اساس pBL-CAT2 كه در آن پروموتر TK برداشته بود طراحي شد pTK-CAT2E-3  كه در پلاسيميد PBL-CAT2 تعداد 72 جفت باز تكراري از اينهنسر SV40(Enhancer) به صورت دوبل به ابتداي ژن CAT اضافه شده بود. PhMT IIA-4 كه تعداد 850 جفت باز داراي محل ويژه برش Hind III/NcoI از پروموتر آن متالوتيونين IIA انساني (HmtIIA) به ژن CAT در ساختمان
 pBL-CAT3  اضافه شده بود اين وكتورها به روي 4 لاين سلولي ماهي و يك لاين انساني به كار گرفته شدند. طوري كه در آن سلولها با ميزان 5/3 پيكومولار از DNA پلاسميد آلوده شدند جزئيات نتايج در جدول شماره يك آمده است.
جدول 1- سنجش فعاليت پروموتر در يك لاين سلولي انسان و چهار لاين سلولي ماهي

    Cell lines    Constructs
‍PSM    A2    EPC    RTH    HepG2    
0.43
n.b.c
100.00
0.55
0.43
(0)
0.40
(0)
0.96
13.26
(13.84)
5.66
(5.91)    0.52
n.b.c
100.00
0.74
4.53
(6.16)
11.62
(15.80)
3.71
99.28
(26.64)
98.12
(26.33)    0.27
3.67
100.00
0.5
10.95
(21.9)
1.02
(2.04)
3.68
139.00
(37.77)
106.67
(29.00)    1.16
3.14
100.00
1.40
39.11
(27.94)
7.18
(5.13)
14.11
480.69
(34.07)+227.48
(16.12)    0.13b
1.00
100.00
0.10
0.33
(3.30)
0.11
(1.10)
1.21
72.56
(69.20)
13.90
(11.50)    pBL – CAT3
pBL – CAT2
pTK-CAT2E
ptMTb CAT
+zinc

+cadmium

phMTIIACAT
+zine

+cadmium

EPC (Carp epithelioma Papulosum) , PTH (Rainbaw trout hepatoma)
Hep (Human hepatoblastoma) , PSM (Xiphophorus interspecific melanoma) , A2 (xiphophorus xiphidium emryonal epitheloid )
جهت بررسي اثرالقاء فلزات بر روي ژن، لاين هاي سلولي ماهي آلوده با پلاسميد ptMTb- phMTIIA – CAT , CAT براي مدت 48 ساعت قبل از برداشت، تحت اثر ZnCI2  يا CdCI2 قرار داده شدند. سنجش CAT بر طبق روش فريدين ريچ (Friedenreich) در سال 1990 انجام شده كه در آن فعاليت پروموتر به وسيله درصد تبديل CAT با مقايسه استيل كلرامفنيل (3-Ac) و كلرامفتيكل (Cm) به شرح زير تعيين شد.

پروموتر tMTb در تمام لاين هاي سلولي به جز لاين سلولي PSM فعال بوده است. بنابراين القاء ناشي از فلزات بر روي پروموتر tMTb بستگي به منشاء سلولها و نوع آنها دارد علاوه بر اين در بين چهارلاين سلولي بيشترين القاء در فعاليت پروموتر در لاين سلولي RTH بوده است و لاينهاي A2 , EPC در مراتب بعد قرار داشتند. اين نتايج در كنار اين حقيقت كه در مهره داران سنتز عمده متالوتيونين در كبد اتفاق ميافتد نشانگر اين است كه، اين تكنيك ميتواند روشي براي ابزار ژن متاتيونين در ساير انواع سلولها باشد. همچنين پلاسميد tMTb= CAT‍‍‍‍ ‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍p را به سيتوپلاسم يكي از دو سلول مرحله جنيني ماهي مدوكا از طريق ميكرواينجكش تزريق كردند و مشاهده شد كه ژن CAT در تعداد محدودي از جنين ها براز شده است. تحقيقات هونگ و همكاران نشان داد كه، پروموتر ماهي در سلولهاي ماهي كارايي بيشتري از ساير سلولها نظير انسان داشته استم. محدوديتهاي زيادي در استفاده از پروموترهاي چند گانه غير متجانس (Heterologous) براي مطالعات ابزار ژن در شرايط زيستي و آزمايشگاهي در زمينه توليد ماهيان ترانسژنيك وجود دارد. با توجه به اينكه پروموتر tMTb نقش غير محسوسي در بيان ذاتي ژن داشته است طوري كه تحت اثر فلزات سنگين القاء شده و سبب ابزار ژن گزارشگر مي شود. اين پروموتر، براي ايجاد ماهيان ترانسژنيك با ژن ساختماني شناخته شده و فهم عمل ژنهاي جديد مناسب است.
2-1- بيان ژن هورمون رشد ماهي در باكتريچ
هورمون رشد يك پلي پپتيد تك زنجيره است كه به وسيله هيپوفيز پيشين توليد و ترشح مي شود. در مهره داران اولين نقش هورمون رشد افزايش رشد سوماتيكي است علاوه بر اين ماهيان استخواني اين هورمون در تنظيم شرايط اسمزي و تعادل الكتروليتي بدن و چندين عمل متابوليكي ديگر نقش دارد. ساختار ژن هورمون رشد و بيان آن، از مدلهاي مهم براي مطالعه رابطه سا ختمان و عمل پروتئين و تنظيم بيان ژن است، طي تحقيقي كه سال 1993 توسط سونگ (Song) و همكارانش انجام شد جداسازي ژن هورمون رشد و توليد پلي پپتيد آن به ميزان بسيار زياد در ميكروارگانيسم ها بررسي شد. در سالهاي اخير در بسياري از ماهيان اين ژن از طريق cDNA كلون شده است.  از جمله در يكي از فعاليتهاي تحقيقاتي ژن هورمون رشد ماهي آزاد چنوك (Chinook salmon) از اين طريق جدا و به باكتري اشيرشياكلي تزريق شده است (Song 1993) در اين تكنيك ابتدا cDNA هورمون رشد و جدا و كلون شد. cDNA 2/1 كيلو جفت باز بوده و در ساختار pSGH4 طراحي شد. سپس دو تا پروب اليگونكلئوتيدي و پرايمر برا‌ي آن ساخته شد.
طراحي پروبها و پرايمرها بر اساس رديف اسيدهاي امينه به روش باندهاي فسفر دي استري روي فاز جامد انجام گرفت. پروب A بر اساس رديف رزيدوهاي 7-1 و پرب B بر اساس رزيدوهاي 172-166 طراحي شدند و به وسيله الكتروفورز روي ژل اكريل آميد خالص گرديدند. همچنين طراحي پرايمرهاي 1و2 بر اساس الگوي cDNA انجام شد. سپس آمپلي فيكاسيون ژن هورمون رشد به وسيله PCR انجام  و محصولات PCR به وسيله الكتروفورز روي ژل آگاروز چك و با اتانل رسوب داده شدند و در قدم بعدي پلاسميد لازم براي بيان ژن طراحي گرديد. و ژن مديفاي شده cDNA هورمون رشد به وسيه آنزيمهاي برش دهنده Bam HI , Eco RI برش به ناقل پلاسميدي كه آن هم به وسيله همين آنزيمها برش شده بود منتقل شد.
سپس پلاسميد طراحي شده به باكتري Ecoli JM105 وارد گريدند نو تركيب به وسيله پروب نشانه گذاري شده A مشخص شدند. كلونهاي كه ژن به آ‌نها وارد شده بود. به نام pmAK5 ناميده شدند. اگر چه جهت تأئيد بيشتر مجدد اين كلونها تحت اثر آنزيمهاي برش دهنده قرار داده شدند و با پروب نشانه B هيربد شدند. سپس اشيرشيا كولي هاي Ecoli K12 – JM105 حاوي پلاسميد pmAK5 كه داراي ژن هورمون رشد بودند در محيط كشت YT كلون شدند. پس از انكوباسيون باكتريها با ايزوپروپيل دي تيوگالاكتو پيرانوزيد (IPTG) براي مدت 4 ساعت در دماي 37 درجه، سلولها جدا و در بافر لايملي (Laemmli 1971) حل و با SDS-PAGE و كماسي بررسي شدند. نتايج نشان داد كه به طور تخمين ميزان 10-6 درصد از مجموع تمام پروتئين سلولي در اشيرشياكولي مربوط به ژن هومون رشد بوده است.

3-1- انتقال ژن به تخم ماهي از طريق ميكروپيل با ميكروپيپت
در سال 1998 بريم و همكاران در تحيقيقي ژن هورمون رشد انسان را از طريق ميكروپيل به صفحه زاياي ماهيان تيلاپيا انتقال دادند رشد ماهيان طي 90 روز بررسي شد. جهت تكثير، تعداد 4 يا 5 ماهي ماده را در كنار يك ماهي نر قرار دادند به طوريكه در شرايط آ‌زمايشگاهي  تخمك گذاري ماهيان ماده انجام و با اسپرم لقاح شدند. تخم هاي لقاح يافته 10 دقيه پس از تخمك گذاري   در شرايط مصنوعي برداشته شدند. تمام تخم ها به انكو باتورهاي ويژه با جريان آب و دماي   منتقل شدند و تا زمان دست كاري نگهداري گرديدند. تزريق به تخم ها در زمانهاي 10 دقيقه و 24-21 و 43-40 ساعت پس از تخمك گذاري انجام شد. ساختار پلاسميدي كه در انتقال ژن به تيلاپيا به كار گرفته شد بنام 1- pXGH در تصوير 4 نشان شده است. اين پلاسميد داراي 31/9 كيلوباز شامل 35/2 كيلو باز از قطعه اي از BPV-1 كه داراي دو محل ويژه برش توسط آنزيمهاي EcoRI , Bam H1 مي باشد. تصوير 4- ساختمان پلاسميد pXGH-1 و جايگاههاي مورد شناسايي آنزيمهاي برش دهنده از طرف ديگر 46/2 كيلو باز آن از قطعه اي از پلاسميد pBR322 و 4 كيلو باز آن كه داراي دو محل ويژه برش توسط Eco RI در دو انتهاي خود مي باشد مربوط به پروموترمتالوتيونين موش mMTI و ژن هورمون رشد انسان ‌hGH كه به آن متصل كرده اند بوده است. اگر چه از اين مقدار 8/1 كيلو باز آن مربوط به پروموترژن متالوتيونين موش و 7/1 كيلو باز آن مربوط به ژن ساختماني هورمون رشد انسان بوده است. در ژن هورمون رشد نواحي اگزون و انترون و ترتيبات غير قابل ترجه در   طراحي شده بود همچنين در سمت   ژن هورمون رشد انسان قطعه اي به اندازه 5/0 كيلو  از فاژ   طراحي شده كه داراي محلهاي ويژه اي جهت برش توسط آنزيمهاي برش دهنده بوده است. علاوه بر اين براي قطعه اي از ژن hGH كه در اثر برش توسط دو آنزيم Bg1 II , Pvn II ايجاد مي شود پروب طراحي شده بود تزريق در يك پتري ديش پر از آب به كمك استريوميكروسكوپ (Wild M8) و دو پيپت انجام شد. تخم ها به كمك يك ميكروپيپت نگهدارنده كه سر آن به شكل فنجان طراحي شده بود مكش و تثبيت و از حركت آنها به طرفين جلوگيري شد. سپس به كمك ميكروپيپت دوم به قطر 5 ميكرومتر محلول حاوي DNA از طريق ميكروپيل به صفحه زاياي تخم ها تزريق شد. مقدار تقريبي 106  كپي از DNA به كمك فشار هوا به هر تخم تزريق شده است. جزئيات تزريق و هچ تا مرحله 90 روز در جدول شماره 2 ذكر شده است.
جدول 2- تعداد تخمهاي مورد تزريق، هچ شده و ما هيان پس از 90 روز
 

انجام پایان نامه

برای دیدن ادامه مطلب از لینک زیر استفاده نمایید

سفارش پایان نامه

نقشه