انجام پایان نامه

درخواست همکاری انجام پایان نامه  بانک مقالات رایگان انجام پایان نامه

سفارش پایان نامه

|

انجام پایان نامه ارشد

 پایان نامه 

انجام پایان نامه|پايان نامه دامپزشکی  250 ص

مقدمه
عفونت پلوروپنوموني واگير،‌ بيماري تحليل برنده تنفسي است كه با جاي گرفتن در طبقه‌بندي بيماريهاي سازمان جهاني كنترل بيماريهاي واگير، لزوم و اهميت شناسايي آن مشخص شده است. عامل اصلي اين بيماري، گونه مايكوپلاسما مايكوئيدس مي‌باشد كه تايپ كلوني كوچك آن  بطور اختصاصي به گله‌هاي گاو، خسارات فراواني ناشي از همه‌گيري گسترده و مرگ و مير فراوان تحميل كرده است.
تايپ كلوني بزرگ اين گونه  همراه با دو گونه ديگر بنامهاي مايكوپلاسما كاپري كولوم كاپري كولوم  و مايكوپلاسما مايكوئيدس كاپري  فرم غيركلاسيك پلوروپنوموني واگير را در گله‌هاي گوسفند و بز بوجود آورده‌اند. اين بيماري در فرم كلاسيك، که عامل آن مايکوپلاسما کاپري کولوم کاپري پنوموني  شناخته مي‌شود، خسارات اقتصادي سهمگيني در گله‌هاي بز و گوسفند موجب گرديده است.
از آنجائيكه منطقه خاورميانه جزو مناطق مشكوك به آلودگي پلوروپنوموني واگير محسوب مي‌شود، حفظ وضعيت عاري بودن از عفونت در اين منطقه، مشكل يا تقريبا غيرممكن بوده و نيازمند بازنگري درراهبردهاي بكار رفته به منظور تشخيص و كنترل اين عفونت‌هاست. عدم برخورداري از خصوصيت پاتوگونوميك تشخيصي و پاتولوژيكي‌، مسير بيماريزايي ناشناخته و تنوع فنوتيپي بسيار پيچيده ارگانيسم در مواجهه با دستگاه ايمني ميزبان، بر مشكل شناسايي آن افزوده است. علاوه بر  اين ، ابقا طولاني مدت باکتري در محل عفونت و وجود ناقلين بدون علامت‌، برنامه كنترل بيماري را با چالش روبرو كرده است.
از اين رو، شناسايي و بكارگيري روشهاي تشخيصي و تفريقي گونه‌هاي كلاستر مايكوپلاسما مايكوئيدس كه هركدام استراتژي جداگانه اي در برخورد با عفونت گله‌ها دارند، از اهميت ويژه‌اي برخوردار است.
 از آنجايي كه مايكوپلاسماهاي پاتوژن در محيط كشت به سختي رشد مي‌كنند، استفاده  متداول از روش كشت و جداسازي، شناسايي عفونت گله‌ها را با مشكل روبرو كرده است.
از طرف ديگر، عمدتا به دليل تشابه آنتي ژنتيكي بين گونه‌هاي كلاستر مايكوئيدس و ساير گونه‌هاي مايكوپلاسما، روشهاي سرولوژي از دقت و ويژگي كافي در تمايز گونه‌ها برخوردار نيستند. لذا به رهيافت روش‌هاي مولكولي مانندPCR بعنوان روشي سريع،  دقيق و با حساسيت و ويژگي مطلوب در كنترل عفونت گله‌ها، توجه ويژه‌اي مي‌شود.
    هدف از اين مطالعه، بررسي عفونت‌هاي تنفسي ناشي از كلاستر مايكوئيدس در  گله‌هاي نشخواركنندگان از طريق كشت و PCR مي‌باشد.
 
چكيده :
          كلاستر مايكوپلاسما مايكوئيدس در برگيرنده مهمترين پاتوژنهاي تنفسي نشخواركنندگان است كه ساليانه، خسارات اقتصادي سنگيني بر صنعت دامپروري كشورهاي جهان وارد مي‌كند. اخيرا شيوعهاي بازپديدي از عفونتهاي پلوروپنوموني نشخواركنندگان در منطقه خاورميانه گزارش شده است. در اين شرايط تعيين وضعيت گله‌هاي كشور از نظر آلودگي به گونه‌هاي پاتوژن اين كلاستر، از اهميت خاصي برخوردار است. هنوز گزارشي از شناسايي و جداسازي گونه‌هاي درگير از عفونت پلوروپنوموني در ايران بدست نيامده است. عدم برخورداري از خصوصيت پاتوگونوميك در نمونه‌هاي باليني و دشواريهاي فراوان جداسازي ميكروارگانيسم، به ضرورت شناسايي و بكارگيري روشهاي تشخيصي جايگزين افزوده است.
          علاوه بر اين، دستيابي به روشي كاربردي و سريع، در تشخيص عفونتهاي تنفسي گله‌ها و تخميني از وضعيت عفونت در ايران، مدنظر اين تحقيق بوده است.
در اين مطالعه‌، 100 نمونه ريه با ضايعات مشكوك به عفونتهاي تنفسي مايكوپلاسمايي از 100  گله مشكوك (50 گله گاو،30 گله گوسفند،20 گله بز) در اطراف كرمانشاه ، در سالهاي 1386-1384 جمع آوري شدند. ضايعات ماکروسکوپي شامل کبدي شدن ريه‌ها با زخم‌هاي خاکستري و سفيد(جامد شدن) و ظاهر منقوط با يا بدون فيبرين بودند. نمونه‌ها در محيط کشت PPLO براث و آگار کشت داده شدند. پس از پاساژهاي متعدد،از 23 گله مشکوک،تک کلوني تخم‌مرغي شکل مايکوپلاسما جداشد(11 گله گاو،8 گله گوسفند،4 گله بز).
اما در واكنش, PCR63  گله عفونت مايكوپلاسماي تنفسي نشان دادند (37 گله گاو، 17 گله گوسفند، 9 گله بز).
اين امر، مبين اين نكته است كه عليرغم اينكه جداشدن عامل مايكوپلاسمايي از نمونه‌ها در محيط كشت، اساس تعيين وضعيت عفونت‌هاي مايكوپلاسمايي قلمداد مي‌شود، اما  سخت‌رشد بودن گونه‌هاي مورد مطالعه در محيط كشت و عدم دستيابي سريع به نتيجه، كارآيي اين روش تشخيصي را در پايش متداول عفونت گله‌ها زير سوال برده است.
     علاوه بر اين، بكاربردن آنتي بيوتيكهاي متنوع در دوره درمان و از بين رفتن ميكروارگانيسم در خلال جمع آوري نمونه، ‌نتايج رشد در محيط كشت مايكوپلاسما را دستخوش تغيير داده است.
از اين رو،‌ استفاده از روشهاي مولكولي PCR بعنوان يك روش كاربردي،  حساس و سريع توصيه مي‌شود. پس از استخراج ‌DNA نمونه‌ها به روش فنل کلروفورم و جدا كردن نمونه‌هاي آلوده به مايكوپلاسما از طريق PCR ، با استفاده از پرايمر اختصاصي كلاستر مايكوئيدس نمونه‌هاي مايكوپلاسمايي تحت واكنش PCR قرار گرفتند.
باند bp 548، تنها در نمونه كنترل ( سويه F38) ديده شد. به منظور كنترل روند واكنش، نمونه‌ها با پرايمر اختصاصي مايكوئيدس كلوني بزرگ و پرايمر اختصاصي آگالاكتيه، به طور جداگانه PCR شدند كه نتيجه اين آزمايش، يافته‌هاي آزمايش قبلي را تائيد مي‌كرد.
 اگر چه اين تحقيق نشان داد كه عامل عفونتهاي تنفسي مشكوك در نمونه‌هاي مورد مطالعه نمي‌تواند از گونه‌هاي كلاستر مايكوئيدس باشد، منتهي تخمين ميزان عفونت در گله‌هاي مورد مطالعه، احتياج به تحقيقات وسيعتر با جمع‌آوري تعداد نمونه‌هاي بيشتر در مطالعات بعدي دارد.



فصل اول:

                               كلـــيات
 
1- تاريخچه
عامل اصلي بيماري پلوروپنوموني واگير گاوان  ـ كه امروزه به نام مايكوپلاسما مايكوئيدس مايكوئيدس بيوتايپ كلوني كوچك  شناخته مي‌شود- در سال ١٨٩٨ براي اولين بار توسط نوكارد  وروكس  شناسايي گرديد. در آن زمان، اولين نام نهاده شده بر اين اجرام، پلوروپنوموني بود كه بعد از اين كه اجرامي با خصوصيت مشابه اين ميكروارگانيسم از منابع ديگر به دست آمد، بنام اجرام شبه پلوروپنوموني نام‌گذاري شد. ٦٠ سال بعد، نواك نام مايكوپلاسما را به عنوان نام ژنريك اجرامي كه فاقد ديواره سلولياند، پيشنهاد كرد (45).
٢- خصوصيات كلي مايكوپلاسما
مايكوپلاسماها، جزو كوچك‌ترين پروكاريوت‌هايند (μm١٥-٠)  كه قادرند از فيلترهاي مخصوص باكتري (μm٤٥-٢٢/٠) عبور كنند. اين اجرام به دليل فقدان ديواره سلولي، اشكال پلي‌مورفيك دارند و به اشكال كروي (μm٣/٠-٩/٠)، رشته‌اي (تا μm١)،گلابي شكل، شاخه‌اي و مارپيچي  در زير ميكروسكوپ الكتروني ديده مي‌شوند. در واقع، بيشتر شبيه به فرم L باكتري‌ها مي باشند.ارگانيسم از سه ارگانل شامل غشا سلولي، ريبوزوم و مولكول حلقوي DNA تشكيل شده است. تصوير مايكوپلاسما در زير ميكروسكوپ الكتروني، شبيه فيلامان (بطري) است كه از دو انتها طويل شده است. اين اندامك‌‌هاي انتهايي ، محل اتصال به غشا يوكاريوت است كه داراي يك ساختمان مركزي ميله مانند  مي‌باشد و توسط غشا احاطه شده است (70).
 مجموعه خصوصياتي مانند عبور از صافي‌هاي مخصوص پالايش باكتري، عدم حساسيت به آنتي‌بيوتيك‌ها و دشواري‌هاي رشد، آن‌ها را شبيه به ويروس‌ها كرده است. ولي وجود محتواي ژنتيكي DNA (٧-٥/١)% و RNA (١٧-٨)% كه توسط غشاي پلاسمايي سه لايه‌اي حفاظت شده است، سبب تمايز آن‌ها از ويروس‌ها، كلاميديا وريكتزياها مي‌شود. به دليل دارا بودن حداقل ژن‌هاي لازم براي تكثير مستقل- كه در حدود   تا   محتواي ژنتيكي E.coli است ـ نيازمند موجودات زنده براي تكثير و زنده‌ماني نمي‌باشند (50).
ولي به هر حال تعداد كم ژن‌ها، منجر به رشد بطئي، ونياز قابل توجه به ميزبان براي تامين برخي از مواد مغذي و بقا شده است. به همين علت بسياري از مايکوپلاسماها به عنوان انگل‌هاي سطحي در غشا مخاطي دستگاه تنفس چشم، ادراري تناسلي، بافت پستاني و مفاصل شناخته شده اند و به ندرت بافت‌ها را مورد تهاجم قرار مي‌دهند (47).
البته انتشار آن‌ها به اندام‌هاي مختلف بيانگر وجود حداقل يك عفونت گذراست. به طور كلي، تنها برخي گونه‌هاي مايكوپلاسما و احتمالاً‌ سويه‌هاي خاص، تمايل بيشتري به بعضي بافت‌ها يا اندام‌ها دارند، هر چند كه اين تمايل به معناي حذف كامل تمايل به ساير بافت‌ها نمي‌باشد. اغلب مايكوپلاسماها، به عنوان آلوده كننده محيط كشت سلولي شناخته مي‌شوند که تشخيص و کنترل آلودگي آنها مشكل است (50).
مايكوپلاسماها با استفاده از توانايي حركت خود كه به صورت سرخوردن است ، خود را به سلول‌هاي هدف مي‌رسانند. اين حركت كند بوده و تحت تاثير آنتي‌بادي‌هاي اختصاصي مهار مي‌شود (74).
بسياري از مايكوپلاسماها، بي‌هوازي اختياري بوده و بعضي به صورت مطلوب در اتمسفري با ١٠ -٥% CO2 رشد مي‌كنند. مايكوپلاسماهاي بي‌هوازي غيرپاتوژن در شكمبه گوسفند و گاو يافت مي‌شود (2).
3-مقاومت مايكوپلاسماها
اين اجرام توانايي توليد ديواره سلولي پلي‌مورفيك و پپتيدوگليكاني را دارند و از همين رو، به آن‌ها باكتري‌هايي  با نقص ديواره سلولي  اطلاق مي‌شود. آنتي‌بيوتيك‌هايي كه بر روي ديواره سلولي اثر مي‌كنند،(دسته بتالاکتامز) مانند پني‌سيلين و سفالوسپورين، آن‌ها را از بين نمي‌برند. اگر چه نسبت به آنتي‌بيوتيك‌هايي كه بر روي سنتز پروتئين اثر دارند (مانند تتراسايكلين) ‌حساسند، ولي اين آنتي‌بيوتيك‌ها در بدن حيوانات زنده زياد موثر نيستند، زيرا گاهي غلظت كافي آن‌ها به سطح اپي‌تليومي كه توسط مايكوپلاسماها احاطه شده است، نمي‌رسد. از خصوصيت مقاوم بودن به پني‌سيلين و استات تاليم، براي جلوگيري از رشد ميكروب‌هاي آلوده كننده محيط كشت استفاده مي‌شود (72).
در آزمايش‌هاي تجربي، مايكوپلاسماها به شوك اسموتيك، ضدعفوني كننده‌هاي محيطي، الكل، گرما و خشكي، آنتي‌بادي‌هاي اختصاصي وکامپلمان حساس مي‌باشند. دماي °C٥٥ به مدت '١٥ و °C٦٠ به مدت '٥ آن‌ها را از بين مي‌برد. براي مثال گونه مايكوئيدس مايكوئيدس در خارج از بدن حيوان بيش از چند ساعت، قادر به ادامه حيات نمي‌باشد، ولي در محل عفونت تا مدت‌ها باقي مي‌ماند. از گاوهايي كه در ١٠ ماه پيش به بيماري پلوروپنوموني واگير مبتلا بوده‌اند، ميكروارگانيسم جدا شده است (72). سكوستراهاي ريوي منبع بالقوه‌اي از آلودگي  هستندو ارگانيسم را براي زماني به مدت ٣ سال نگهداري مي‌كنند. به همين علت، كانون‌هاي عفونت در اكثر موارد، حيوانات بهبود يافته‌اند. تركيبات ديگر از قبيل جفت و ادرار نيز مي‌توانند ارگانيسم‌ها را براي مدت طولاني زنده نگه‌دارند. گزارش شده است كه يونجه آلوده به ميكروارگانيسم تا مدت ١٢٤ ساعت، قادر به انتقال آلودگي است. هم‌چنين در ريه منجمد تا چندين ماه و در محيط كشت خشك شده در خلا، چندين سال زنده مي‌ماند. فنل ١%، فرمالين ٥/٠% و كلريد جيوه ١% به مدت چند دقيقه ميكروارگانيسم را از بين مي‌برند (44).
4-طبقه‌بندي مايكوپلاسماها
با استفاده از آناليز توالي ژن 16S-rRNA، تصور مي‌شود كه مايكوپلاسماها در حدود ٦٠٠ ميليون سال قبل با از دست دادن قسمت‌هاي غير ضروري ژنوم خود، از جمله ژن‌هاي سنتز ديواره سلولي از باكتري‌هاي گرم مثبت و مشخصاً كلستريديومها مشتق شده‌اند (50).
از نظر فيلوژني، مايكوپلاسماها به كلاس Mollicutes، رده Mycoplasmatales و خانواده Mycoplasmatacea تعلق دارند. كلاس Mollicutes، بيش از ١٠٠ گونه از مايكوپلاسماهاي گياهان، مهره‌داران و حشرات را در بر مي‌گيرد و از ٥ جنس تشكيل شده است كه در ميان آن‌ها، مايكوپلاسما، اوروپلاسما  و آنئروپلاسما ، بيشترين ميزبانان را در انسان و حيوان دارا هستند. (جدول٢)
بر اساس آناليز توالي قطعه V2 از ژن 16S-rRNA، مايكوپلاسماها به ٤ دسته تقسيم‌بندي شده‌اند: ١ـ پنوموني، ٢ـ هومي‌نيس ، ٣ـ اسپيروپلاسما و ٤ـ آئروپلاسما.
سه گونه مايكوپلاسماي بيماري‌زا در انسان، پنوموني،‌هومي‌نيس و اوروپلاسما هستند كه به ترتيب اختلالات تنفسي، و يوروجنيتال را به وجود مي‌آورند.بيماري‌زاترين گونه‌ها در نشخواركنندگان، متعلق به كلاستر مايكوئيدس است كه در دسته اسپيروپلاسما جاي گرفته است (9) .اعضا اين كلاستر كه عمدتاً مسئول عفونت‌هاي تنفسي هستند، از نظر خصوصيات آنتي‌ژنتيكي و فنوتيپي، وجه اشتراك زيادي دارند كه تمايز و تفكيك آن‌ها را در تست‌هاي متعارف آزمايشگاهي با چالش روبه‌رو مي‌كند. جدول ٢ به معرفي اعضا اين كلاستر و ميزبانان اصلي آن‌ها پرداخته است. در ميان اعضا، مايكوپلاسما مايكوئيدس مايكوئيدس بيوتايپ كلوني بزرگ  و مايكوپلاسما كاپري‌كولوم كاپري‌پنوموني  از مهم‌ترين پاتوژن‌هاي شناخته شده در نشخواركنندگان هستند. بيماري پلوروپنوموني واگير گاوان و پلوروپنوموني واگير بزان، دو بيماري مطرح شده در فهرست  A و B سازمان جهاني كنترل بيماري‌هاي واگير جانوري اند كه تشخيص و گزارش وقوع آن‌ها، جهت احراز اقدامات فوري اجباري است (72).
 
جدول ١: طبقه بندي مايکوپلاسما

Mycoplasmatacea    Family:
Mycoplasmatales    Order:
Mollicutes    Class:
Mycoplasma    Genus:




جدول ٢:معرفي اعضا کلاستر مايکوييدس و خصوصيات بيماريزايي  آنها

بيماري‌زايي    ميزبان اصلي    نام ميكروارگانيسم
Contagious Bovine Pleuro Pneumonia (CBPP)    گاو    1) Mycoplasma mycoides mycoides Small Colony (MmmSC)
MASKePs Syndrome    بز    2) Mycoplasma mycoides mycoides Large Colony (MmmLC)
MASKePs Syndrome    بز، گوسفند     3)Mycoplasma mycoides capri (Mmc)
MASKePs Syndrome    بز، گوسفند    4) Mycoplasma   capricolum Capricolum (Mcc)
Contagious Caprine Pleuro Pneumonia (CCPP)    بز    5) Mycoplasma  capricolum capripneumonia (Mccp)
Unknown    گاو    6) Mycoplasma Bovine Serotype 7
ساپروفيت    جوندگان    7) Mycoplasma cowetti
ساپروفيت    موجودات زنده    8) Mycoplasma yeasti
Mastitis,Arthritis,CA    موجودات زنده    9) Mycoplasma putrificans







5-طبقه‌بندي كلاستر مايكوئيدس

اعضا اين كلاستر شامل مايكوپلاسما مايكوئيدس مايكوئيدس كلوني كوچك (MmmSC)، مايكوپلاسما مايكوئيدس مايكوئيدس كلوني بزرگ (MmmLC)، مايكوپلاسما كاپري‌كولوم كاپري‌پنوموني (Mccp)، مايكوپلاسما كاپري‌كولوم كاپري‌كولوم (Mcc)، مايكوپلاسما مايكوئيدس كاپري (Mmc)، سروتيپ ٧ سويه گاوي (M.bsg7)، مايكوپلاسما پوتري‌فيكنس (M.putrificans)، مايكوپلاسما كووتي (M.cowetti) و مايكوپلاسما يستي (M.yeasti) مي‌باشند. دو گونه آخر جز مايكوپلاسماهاي ساپروفيت اند كه بيماري‌زايي آن‌ها در شرايط عادي در نشخواركنندگان نامعلوم است و پوتري‌فيكنس از مبتلايان به سندروم نقص ايمني انسان نيز جدا شده است (47).
خسارات اقتصادي ناشي از بيماري‌زايي و حضور اعضا اين كلاستر در نشخواركنندگان، از اهميت زيادي برخوردار است، به طوري كه بيماري ناشي ازMmmSC -پلوروپنوموني واگير گاوان (CBPP)- از مهم‌ترين معضلات مطرح اقتصادي در صنعت دامپروري در آفريقا و اخيراً در اروپاست كه براي ساليان متمادي كشورهاي زيادي را درگير كرده است)45).
هم‌چنين در حال حاضر، پلوروپنوموني واگير بزان (CCPP)، بيشترين خسارات اقتصادي را در آفريقا ايجاد مي‌كند كه پس از طاعون نشخواركنندگان كوچك ، دومين بيماري قابل توجه را در گله‌هاي بز را به وجود آورده است (17).
MmmLC،Mcc و Mmc سندروم MASKePs  را در گله‌هاي گوسفند و بز ايجاد مي‌كنند كه متداول‌ترين تظاهرات بيماري با تورم پستان باليني، التهاب مفصل، سپتي سمي، تورم قرنيه و پلوروپنوموني در بالغين همراه است. در بزغاله‌ها پنوموني، سپتي‌سمي و التهاب  عمومي مفاصل در اين سندروم ديده مي‌شود (52).
بيماري‌زايي bsg7 يا Msp7 كه در عفونتهاي همزمان با سويه P650 آغاز مي‌شود، هنوز در دست تحقيق است. اخيراً همه‌گيري‌هايي در گله‌هاي گاو با علايم سقط، التهاب مفاصل و تورم پستان در استراليا ديده شده كه اين عامل از آن‌ها جدا گرديده است (26). گونه پوتري‌فيكنس عامل تورم پستان والتهاب مفاصل شناخته شده، ولي آنتي‌ژنيستي اين گونه و M.cowetti و M.yeasti با ساير اعضا كلاستر  به طور بارزي متفاوت است، لذا به طور معمول به عنوان اعضا كلاسيك كلاستر مايكوئيدس محسوب نمي‌شوند. به هر حال، آناليز فيلوژني ژن 16S-rRNA، آن‌ها را در يك كلاستر قرار داده و نشان داده است كه قرابت ژنتيكي گونه‌هاي   cowetti و yeasti، ٧/٩٩% و با پوتري‌فيكانس ٩/٩٨% است (52).
6-فيلوژني    
اولين قدم در طبقه‌بندي موليكيوتها به وسيله روش‌هاي ملكولي و ايمني شناسي برداشته ميشود. تاکنون اطلاعات تاكسونومي با ارزشي به دست آمده است، اما از روند تكامل اطلاعات زيادي در دست نميباشد. اخيراً، بررسي ارتباط‌هاي فيلوژني موليكيوتها بر روي مناطق ريبوزومي RNA كه بسيار حفاظت شده است، متمركز گرديده است. اين مناطق حفاظت شده به نسبت كل ژنوم مايكوپلاسما، بسيار كمتر دستخوش تغيير مي‌شوند. امروزه توالي كامل ٤٥٠ باكتري، شناخته شده است (50).
ويسبرگ  در مطالعه‌اي، توالي كامل ژن16S-rRNA را در بالغ از ٤٠ گونه موليكيوتها و باكتري‌هاي ديواره‌دار تعيين كرد. اين تحقيقات نشان داد كه موليكيوتها در گروه استرپتوكوكوس ـ لاكتوباسيل ـ باسيل كه باكتري‌هاي G+ با محتواي اندک G+C هستند، قرار ميگيرند و ازنياکان كلستريديوم‌ها مشتق شده‌اند.
آناليز توالي ژنrRNA نشان مي‌دهد كه گونه‌هاي   Mmm و M.capricolum متعلق به يكي از ٥ گروه موليكيوتهاهستند كه در دسته اسپيروپلاسماها جای گرفته اند (71).نتيجه اين انشعاب، كاهش در سايز 1000KD ژنوم به KD٥٠٠ در جنس مايكوپلاسما و اوروپلاسما است (47).

.

انجام پایان نامه

برای دیدن ادامه مطلب از لینک زیر استفاده نمایید

سفارش پایان نامه