انجام پایان نامه

درخواست همکاری انجام پایان نامه  بانک مقالات رایگان انجام پایان نامه

سفارش پایان نامه

|

انجام پایان نامه ارشد

 پایان نامه 

انجام پایان نامه ارشد|تعيين ژنوتايپ ويروس هپاتيپ B در اهداء كنندگان 3 استان كرمان، يزد و اصفهان   75 ص

پایان نامه


روش اجرا
نوع مطالعه، جامعة مورد مطالعه و نمونه گيري
نوع مطالعه : توصيفي
جامعة مورد مطالعه : افراد اهداء كننده
تعريف انواع اهداء كننده :
اهداء كننده بار اول : به اهداء‌كننده‌اي گفته مي‌شود كه براي اولين بار مبادرت به اهداء خون كرده است.
اهداء كننده با سابقه : اهداء كننده‌اي است كه سابقه يك بار اهداء خون در طي ساليان گذشته را داشته باشد.
اهداء‌ كننده مستمر : اهداء كننده‌اي است كه حداقل در طي يكسال دوبار به اهداي خون مبادرت نموده است.
روش نمونه گيري : نمونه گيري بصورت تصادفي ساده مي‌باشد.
روش انجام كار : براي جمع آوري اطلاعات از افرادي كه جهت اهداي خون مراجعه مي‌كنند از روش مصاحبه مشاهده و آزمايش استفاده مي‌شود و نمونه افرادي كه HDSAG آنها باشد جهت مطالعه انتخاب مي‌شود. ابتدا بر روي نمونه‌ها عمل استخراج DNA ويروس ؟ B انجام مي‌پذيرد سپس با استفاده از پرايمر اختصاصي جهت ژن B و با استفاده از روش mested PCR ژنP تكثير مي‌شود آنگاه محصول PCR تعيين توالي مي‌شود.
نحوه اجراي تحقيق : مطالعه انجام شده يك مطالعه قطعي مي‌باشد كه بر روي اهداء كنندگان خون 3 پايگاه يزد، اصفهان و كرمان انجام مي‌شود به هنگام نمونه گيري از هر يك از اهداء كنندگان خون درخواست شد تا پرسش نامه‌اي را تكميل نمايند كلية مشخصات اهداء كنندگان شامل نام و نام خانوادگي، سن و جنس و تحصيلات و دفعات اهداء خون و عوامل و غيره‌ ثبت و ضبط شده باشد (پرسشنامة صفحه بعد) و 120 نمونه خون HBSAG جهت مطالعه جمع آوري شد.
هدف تحقيق :
هدف اصلي اين مطالعه تعيين ژنوتايپ ويروس هپاتيپ B در اهداء كنندگان 3 استان كرمان، يزد و اصفهان است.
برنامه آناليز آماري كه بر روي اطلاعات خام انجام گرفته است:
در اين پژوهش پس از تعيين داده‌هاي خام بدست آمده و وارد كردن آنها به كامپيوتر و افزودن نتايج حاصل از آزمايشات انجام شده به آنها با استفاده از برنامه از نوشته شده (SPSS) جداول توصيفي گرديده‌اند براي تعيين ارتباط (معنا دار بودن) از آزمون cha square يا xf استفاده شد فرول آزمون به ترتيب زير است :
 
 درجه آزادي
اختلاف معنا دار p<0/05 در نظر گرفته شد.
 
آزمايش مولكولي :
براي تخمين ويروس هپاتيت B از روشهاي سرولوژي و براي شناسايي‌اش از روش مولكولي استفاده مي‌شود PCR براي شناسايي ويروس درخون روشي بسيار اختصاصي و حساس مي‌باشد و حضور ميزان كمي از DNA HBV ممكن است براي زمان طولاني مرسوم قابل بررسي باشد و ابزار مناسبي براي تشخيص DNA ويروس در خون مادر؛ جنين و مايع آمونياك محسوب مي‌شود به طور كلي DNA ي يكي از انواع PCR كه در تعيين DNAي ويروس هپاتيت B‌نيز به كار مي‌رود nested PCR است كه با پرايمرهاي اختصاصي   در برخي مطالعات استفاده شده است علاوه بر pcr nested از Red times PCR نيز براي تشخيص DNA HBV استفاده مي‌شود.
به منظور انجام PCR  در ابتدا بايد به DNA HBV دست يافت. بنابراين استخراج DNA صورت مي‌گيرد و پس از آن PCR انجام مي‌گيرد و در نهايت جهت بررسي اين كه DNAي HBV در نمونة مورد بررسي حضور داشته است يا خير از روش ژل الكتروفروز استفاده مي‌شود.
استخراج DNA
از كميت استخراج اسيد نوكلئيك با خلوص بالا بر روي استخراج DNA HBV استفاده مي‌شود اين كميت براي خالص سازي اسيد نوكلئيك ويروس از سرم، پلاسما يا خون كامل پستانداران طراحي شده است.
پوشش ليپدي سلول پستاندارد در حضور پروتئيناز K و Glanidine تخريب مي‌شود اسيد نوكلئيك موجود در محيط آزمايش به طور انتخابي به فيبرهاي شيشه‌اي مخصوص در سلولهاي حاوي فيلتر متصل مي‌شوند. در نهايت پس از طي مراحل شست و شو، تركيبات سلولي حذف مي‌گردد و اسيد نوكلئيك خالص در اتصال با فيلتر باقي مي‌ماند. افزودن بافر رقيق كننده باعث رها شدن اسيد نوكلئيك از فيلتر مي‌شود.
PCR  
PCR يا واكنش زنجيره‌اي پلي مر از روش ساده و در عين حال ظريف است كه براي تكثير قطعه‌اي خاص از توالي DNA در شرايط آزمايشگاه كاربرد دارد. در اين روش با انجام يك واكنش آنزيمي ميليون‌ها نسخه از توالي مورد نظر بدست مي‌آيد.
در 1971، روشي براي تكثير يك منطقه از DNAي دو رشته‌اي با استفاده از دو آغازگر (Primer) ساختگي طراحي شده با وجود در دست بودن اين مفهوم، روش استفادة مكرر از اين امر براي انجام تكثير Amplification تا 12 سال بعد، كري موليس (kavy mullis) در بهار 1983 ، اين ايده را در ذهن خود پرورش داده و در نهايت در 19910 م فرايند PCB را ابداع كرد. مطرح نشده بود موليس در 1993 م، به خاطر اين كشف موفق به دريافت جايزة نوبل گرديد. روش PCR مطابق اسلوبي است كه داخل هستة سلول براي براي از ياد DNA در زمان تقسيم رخ مي‌دهد. در سلول زنده يك فرايند پيچيده ناشي از عملكرد بروتيشن‌هاي مختلف موجب همانند سازي ژنوم مي‌گردد كه در ساده ترين تعريف مي‌توان گفت در همانند سازي DNA دو رشته از هم گسيخته مي‌شود و هر رشته از مولكول اوليه به عنوان الگوي ساخت رشتة‌ مكمل به كار مي‌رود. همانند سازي در اين مرحله بر اصل ارائه شدة واتسون – كه يك استوار است؛ اصلي كه بيان ميدارد نوكلئوتيد A همواره با نوكلئوتيدT ، و نوكلئوتيدC با نوكلئوتيد G جفت مي‌شود (saiki et al 1985)
در PCR، يك سيستم بافري وجود دارد كه در آن DNA پليمر از توالي خاصي از مولكول DNA را تكثير مي‌دهد. در اين سيستم اكسي نوكلئوتيدها به عنوان واحدهاي ساختماني براي ساخته شدن رشتة جديد به كار مي‌روند. در اين ميان پرايمرهاي اليگونوكلئوتيدي اختصاصي ناحيه‌اي خاص از رشته الگو را براي همانند سازي برجسته مي‌سازند.
PCR سه مرحله دارد كه با استفاده از تغييرات دما انجام مي‌شود.
1- تقليب (Donaturation) در اين مرحله، DNA الگوي دو رشته‌اي بوسيلة گرما تقليب مي‌شود. عموماً اين كار در دماي ْc95 صورت مي‌گيرد.
2- به هم پيوستن Annavling مخلوط واكنش تا رسيدن به دماي اتصال به سرعت سرد مي‌شود و در اين حالت امكان اتصال و هيبريد شدن پرايمرها را با الگو فراهم مي‌آورد. در اين مرحله آنزيم DNA پلي مر از مقاوم به گرما مي‌تواند فرايند تكثير را آغاز كند.
3- ساخت DNA : با توجه به دماي بهينة كاركرد آنزيم DNA پلي مر از مقاوم گرمايي، مخلوط واكنش، تا Cْ72 گرم مي‌شود تا تكثير DNA انجام شود.
مهمترين متغيرهاي تاثير گذار در اختصاصي بودن يك واكنش PCR عبارتند از دماي به هم پيوستن، برنامه و تعداد چرخه و تركيب بافر اختصاصيت بالا در PCR با بهينه كردن موارد زير حاصل مي‌شود.
1-    غلظت بهينة Mg+2 ساير يون‌ها، پرايمرها، DNTP ها وdna پلي مر از
2-    تقليب موثر، دماهاي اتصال بالا و بالا بودن سرعت تغيير دما (Ramping Rate)
3-    محدود كردن تعداد چرخه‌ها و طول مدت آن‌ها
4-    كلايي دستگاه ترموسايكلر
5-    افزودني‌هاي PCR
6-    كيفيت الگو
7-    Nested PCR (2006 Mcpherson et al.)

PCR Nested :
در روش PCR Nested از دو جفت پرايمر استفاده مي‌شود به طوري كه جفت دوم در بين جفت اول جاي مي‌گيرد در اين روش، ابتدا پرايمر بيروني توالي هدف، در طول 15-30 چرخه تكثير مي‌شود كه احتمال دارد به ميزان دلخواه اختصاصي نباشد. سپس محصول PCR حاصل به لوله‌اي ديگر منتقل مي‌شود و به عنوان الگو و با استفاده از جفت پرايمر داخلي مرحلة دوم PCR انجام شده و ترادف كوچكتري از DNA كه درون محصولPCR رولي است به اندازة 15-40 چرخة تكثير مي‌شود كه خصوصيت آن، تكثير قسمت داخلي تر يا به عبارت ديگر اختصاصي تر مي‌باشد. مزاياي اين روش تغيير يافتة PCR عبارت است از :
1)    نياز به پروپ (كاوشگر) و تأييدهاي بعدي كمتر است.
2)    حساسيت در اين روش به ميزان زيادي بالاتر است.
3)    به دليل انتقال محصول PCR دور اول به لولة جديد، ممانعت كننده‌ها رقيق مي‌شود (يعني 1386)
ژل الكتروفروز :
يكي از روش‌هاي متداول مشاهدة محصولات واكنش PCR (به طور كلي DNAي دو رشته‌اي رنگ آميزي DNA با اتيديون برومايه و بارگذاري (LOAD) درون چاهك بر روي ژل آكارز است. آگار مخلوطي از دو پلي ساكاريد آگارز و آگاروپكتين است كه از چند جلبك دريايي بدست مي‌آيد. خاصيت ژله‌اي آگار به طور عمده بدليل وجود آگارز است و خصوصيات نامطلوب آن در حين (الكترواسموز و كد رشدگي) از آگاروپكتين ناشي مي‌شود. انواع مختلفي از آگارز را شركت‌هاي سازنده توليد مي‌كنند كه تفاوت آن‌ها در ميزان خلوص آگارز از نظر عدم حضور پلي ساكاريدهاي باردار(كه موجب الكترواسموز مي‌شوند) درجة ذوب، قوام و ميزان شفافيت است با برقراري يك جريان  الكتريكي و در حضور بافر عبور دهندة جريان، قطعات DNA كه داراي بار منفي هستند، بر مبناي طول خود با سرعت‌هاي متفاوتي در ژل آگارز حركت مي‌كنند از قطب منفي به سمت قطب مثبت مي‌روند و بنابراين به تفكيك طول از يكديگر جدا مي‌شوند در اين حالت اگر يك رنگ آشكار ساز مانند اتيديوم برومايد در بافر الكتروفروز يا ژل موجود باشد در لابه‌لاي بازهاي DNA ي دو رشته‌اي وارد مي‌شود و با استفاده از پرتوهاي (ultro violet) همچنين با استفاده از يك اندازه نماي SONA (DNA sizar marker) با پله‌هايي به طول متخصص (به عنوان راهنما براي بررسي نمونه‌هاي آشكار شده روي ژل) مي‌توان DNA را بر روي ژل مشاهده كرد.
توجه به اين نكته ضروري است كه قدرت تفكيك ژل در يك محدودة مشخص نسبت مستقيم با غلظت ژل دارد. بنابراين براي آشكار سازي قطعات كوچك يا در مواردي كه هم زمان دو يا چند قطعه با تفاوت طول كم در يك نمونه وجود دارد كه احتياج به تفكيك بيشتر است، از ژل غليظتر و براي قطعات بزرگتر يا در مواردي كه  هم زمان دو يا چند قطعه با تفاوت طول بيشتر در يك نمونه وجود دارد كه احتياج به تفكيك خيلي بالا نيست، از ژلي با غلظت كمتر استفاده مي‌شود.
تعيين توالي مولكول DNA  (Soguncing)
امروزه تعيين توالي DNA در زمره انديشمندترين ابزارهايي است كه در زيست شناسي ملكولي براي شناسايي و تعيين محل دقيق نوكلئوتيدها در ساختمان ژن‌ها مورد استفاده قرار مي‌گيرد.
نخستين بار فردريك سنگر (1974) روش تعيين توالي A را با استفاده از دي اكسي نوكلئوتيدتري فسفات‌ها و بر مبناي ساخت DNA معرفي نمود قرار گرفتن اين نوكلئوتيدها كه در محل 3 كلكول قند فاقد اكسيژن هستند در عين پليمراسيون در طول زنجيره DNA موجب ختم سنتز رشته جديد مي‌گردد و در صورتي كه بين نوكلئوتيدهاي راديواكتيو نشاندار شده باشند مي‌توان محل نوكلئوتيدها را در هر رشته متخصص نمود.  
تقريباً به صورت همزمان روش ديگري براي تعيين توالي بوسيله الن ماگنتام والترگيلبرت ابداه شد كه به روش شكسته شدن شيميايي معروف است در اين روش DNA در محل هر يك از نوكلئوتيدهاي چهار گانه بوسيله مواد شيميايي خاصي شكسته مي‌شوند كه پس از الكتروفروز محل نوكلئوتيدها در زنجيره DNA قابل خواندن خواهد بود.
با آغاز پروژه ژنوم انسان روشهاي جديد و سريعتري براي تعيين توالي ماده ژنتيكي سلولها مورد نياز بود. در نظر داشت ه باشيد كه محققان مجبور بودند 3 ميليون جفت باز سازنده ساختار ژنتيكي انسان را تعيين توالي كنند. با استفاده از روشهاي متداول در حدود 10 سال زمان صرف ميليونها دلار براي اين پروژه پيش بيني مي‌شد در نتيجه محققين درصدد ابداع روش سريعتر براي تعيين توالي برآمدند. تعيين توالي اتوماتيك DNA بعنوان روش جايگزيني با سرعت و دقت بالا توسط دانشمندان بخش زيست شناسي ساختاري LBL ابداع شد كه 100-50 برابر سريعتر از روشهاي پيشين بود در تعيين توالي اتوماتيك نوكلئوتيدها بجاي راديواكتيو با رنگ‌هاي فلورسانت نشانه دار شده در حين اكترفروز قطعات بر روي ژل اكريل آميد به محلي مي‌رسند كه با اشعه ليزر برخورد كرده و پس از تهييج نور فلورسانت خاصي ايجاد مي‌شود كه بوسيله دستگاه آشكار ساز دريافت شده و به پيام الكتريكي تبديل مي‌شود اين پيامها به كامپيوتر منتقل شده و تا پايان واكنش داده‌ها بصورت اتوماتيك و بوسيله نرم افزارهاي ويژه پردازش شده پيكها شناسايي گرديد و تواليها كه بصورت فايل متني درآمده‌اند در اختيار استفاده كنندگان قرار مي‌گيرد بدست آوردن نتايج مطلوب و قابل اطمينان از تعيين توالي اتوماتيك تا حد زيادي منوط به تهيه DNA عاري از هر گونه آلودگي با غلظت مناسب مي‌باشد. هر گونه آلودگي اعم از نمك، پروتئين، كربوهيدرات، پرايمرها، يا مقدار زياد DNTP به داده‌هاي حاصل از تعيين توالي تاثير مي‌گذارد استفاده از كميت‌هاي تجاري تهيه و تخليص DNA كه معمولاً سريع، خوب و قابل اطمينان است معمولاً براي تهيه نمونه DNA در سيستم تعيين توالي اتوماتيك پيشنهاد مي‌شود.
كميت‌هاي تخليص DNA به دو روش اساسي بيوشيميايي هستند. فيلتر سيليكا كه جدا سازي را بر حسب اندازه نمونه انجام داده و مرحله جداسازي DNA در آب صورت مي‌گيرد و ديگر ستون‌هاي تعويض آنيوني كه مرحله جداسازي DNA در حضور غلظت بالايي از نمك صورت مي‌گيرد. تجربه نشان داده است كه نمونه DNA تخلبص شده بافنل – كلروفرم در سيستم تعيين توالي اتوماتيك نتايج مطلوبي نمي‌دهند. استفاده از بافرهاي استات پتانسيم براي تهيه نمونه DNA در سيستم تعيين توالي اتوماتيك ترجيح دارد. در صورت استفاده از ستون‌هايي كه بافر جداسازي انها حاوي غلظت بالايي از نمك است مي‌توانيد يك مرحله اضافي رسوب دهي با الحات آمونيوم (57/757/0) اتانول مطلق 70% در دماي اتاق انجام دهيد تا نمك‌هاي اضافي از نمونه شما حذف گردد مقدار اضافي كمك واكنش تعيين توالي را متوقف مي‌نمايد DNA جدا شده با بافر غليظ نمكي از ستون و يا پس از رسوبدهي حداكثر نمك را طي شست و شو با اتانل 70% (حداقل 1 بار و حداكثر 4 بار) بايد حذف نمود.
2-3-2 آزمون مولكولي
1-2-3-2 استخراج DNA
از كميت استخراج اسيد نوكلئيك با خلوص بالا (High pure nuckic acidkit) با بر حسب تجاري Roche و شماره كاتالوگ  11858874001 براي استخراج DNAي HBV استفاده شد. اين كميت براي خالص سازي اسيد نوكلئيك ويروس ناز سرم، پلاسما يا خون كامل پستانداران طراحي شده است.
مزاياي استفاده از اين كميت :   
1-    عدم استفاده از مواد سمي فنل يا كلروفرم
2-    عدم نياز به استفاده از اتانلي براي رسوب دادن اسيد نوكلئيك
3-    آسان بودن روش انجام استخراج در مقايسه با ساير روشهاي استخراج
4-    كاهش زمان انجام آزمايش در مقايسه با ساير روشهاي استخراج
5-    امكان استخراج RNA , DNA هاي ويروس موجود در نمونة مرد بررسي به طور همزمان

 
معرفهاي موجود در كيت
جدول 7-2 : معرفهاي موجود در كيت استخراج اسيد نوكلئيك
معرف    برچسب گذاري    محتويات / كاركرد
1- سبز رنگ     Binding Buffer    2x25:
Tris- Hd,20%   GM guanidine- Hd, 10m
(C ْTriton x – 100 (w/v), Ph4.4 (25
2-     Poly (A)    1yophilizate
2mg poly (A) carrier RNA
For binding DNA
3- صورتي رنگ    Proteinasek    Lyophilizate
100mg
For the diyestion of proteins
4- سياه رنگ    In hinbitor
Removal
Buffer     33ml, add 20 ml absolute ethanol 5 guanidine – Hd,
final conectration after addition of ethanol  cْ25 20Mm Tris – Hd, Ph 6.6
4- آبي رنگ     Wash Buffer     2* 10ml add 40 ml ethanol p.a each
(Cْ25)20mM Nocl , 2Mm Tris- Hd, PH7.5
Final conectrations ofter addition of ethanol
5- بي رنگ     Elution Buffer    30 ml
Nuclease – free , sterile , double disthlled water
6-    High pure filter    Two bags with 50 poly propylene tubes with two layers of glass fiber fleece, for use of up to 700 ml samples volune
7-    Collection tubes     Eight bags with 50 polypropylene tubes (2ml)
 
نگهداري و ماندگاري كميت :
مطابق با دستورالعمل كيت، محتويات اين كيت در دماي Cْ15 تا Cْ25 نگهداري شوند. نگهداري كيت در دماي Cْ2 تا Cْ8 درجة‌ (دماي يخچال) يا Cْ15- تا Cْ25- (دماي فريزر) موجب ايجاد شرايط نامطلوب در محلولهاي موجود در كيت مي‌شود.
توصيه مي‌شود محلول RNA حاصل (poly / A در مقدارهاي كم در ظروف جداگانه توزيع و نگهداري شود اين مقادير در دماي Cْ15- تا Cْ25- به صورت 12 ماه ماندگاري دارند.
 
جدول 8-2 : آماده سازي محلولهاي موجود در كيت استخراج اسيد نوكلئيك High puro ? ascid kit  
محتويات    ساخت مجددي آماده سازي    نگهداري و ماندگاري    مورد مصرف
بروتئيناز K     انحلال پروتئيناز K در ml5 بافر رقيق كننده     توزيع محلول حاصل و نگهداري در ماي cْ15- تا cْ25- به مدت 12 ماه     تخريب سلول
RNN حاصل Poly A     انحلالRNA حاصل (A) POLY در ml5/0 بافر رقيق كننده و توزيع محلول حاصل به ميزان ml50      نگهداري در دماي cْ15- تا cْ25-     آماده سازي محلول مورد استفاده
    مخلوط با ml 50RNA حاصل (POLY) با ml5/2 بافر متصل شونده     تهيه قبل از مصرف    عملگر در مرحلة اول واكنش
بافر حذف كننده باز دارنده     افزودن ml200 اتانول به بافر ممانعت كننده انتقال     نگهداري در دماي 15 تا cْ25     حذف باز دارندة PCR
بافر شست و شو     افزودن ml40 اتانول مطلق به بافر شست و شو     نگهداري در دماي 15 تا c25     حذف ناخالصي‌هاي باقي مانده در محيط واكنش
 
مراحل استخراج
تمام مراحل، زير مود ميكروبيولوژي كلاس II انجام شد.
1-    مطابق روش كار كيت استخراج، چون از خون كامل در آزمايش استفاده شد بافر رقيق كننده قبل از استفده در دماي Cْ70 پيش بيني گرديد.
2-    به لولة ميكروسانتريفوژ  110 فاقد نوكلئاز  200 سرم و  200 بافر اتصال و  50 محلول بروتئناز K اضافه Mix فوري محتويات لوله و سپس لولة سانتريفوژ به مدت 10 دقيقه در دماي cْ72 نگهداري شد.
3-     100 بافر اتصال به محتويات لولة سانتريفوژ افزوده مخلوط شد.
4-    لوله‌ حاوي فيلتر استخراج در داخل لولة جمع آوري قرار داده شد. تمام محتويات موجود در لولة سانتريفوژ ؟ به لولة فيلتر دار منتقل شد.
5-    به مدت 1 دقيقه در g×1000 سانتريفوژ شد.
6-    پس از سانتريفوژ، لولة فيلتردار به لولة جمع آوري جديد منتقل و مايع حاصل از سانتريفوژ دور ريخته شد.
7-     500 بافر حذف كنندة بازدارنده به لولة فيلتردار افزوده شد.
8-    به مدت 1 دقيقه در g ×8000 سانتريفوژ شد.
9-    پس از سانتريفوژ، لولة فيلتردار به لولة جمع آوري جديد منتقل و مايع حاصل از سانتريفوژ دور ريخته شد.
10-      450 بافر شست و شو به لولة فيلتر دار اضافه شد.
11-    به مدت 1 دقيقه در g×8000 سانتريفوژ شد.
12-    پس از شست و شو سانتريفوژ، لولة فيلتردار به لولة جمع آوري جديد منتقل، و مايع حاصل از سانتريفوژ دورريخته شد.
13-     45 بافر شست و شو به لولة فيلتر دار اضافه شد.
14-    به مدت 1 دقيقه در g×8000 سانتريفوژ شد.
15-    سپش از شست و شو سانتريفوژ، لولة فيلتر دار به لولة ميكروسانتريفوژ mol5/1 منتقل، و مايع حاصل از سانتريفوژ دور ريخته شد.
16-     50 الوشن بافر به لولة فيلتر دار اضافه شد.
17-    به مدت 1 دقيقه در g×8000 سانتريفوژ شد.
18-    پس از شست و شو سانتريفوژ، لولة فيلتردار را دور ريخته و ميكروسانتريفوز  1/5 كه حاوي DNA استخراج شده است تا زمان انجام PCR در دماي Cْ20- نگهداري شد.

PCR
پس از استخراج HBV DNA به منظور توليد انبوه ژنوم ويروس از روش nested PCR استفاده شد:
 20 از آميزة PCR (كه در جدول 9-2 ذكر شده است) به  4 DNAي استخراج شده افزوده شد.
 جدول 9-2 : مواد مورد نياز در انجام مرحله اول pcr Nested
مواد    مقدار    غلظت
بافر PCR     5/2
X10
dNTP     5/0
mm10
Mgd2       5/2
mm25
Taq پليمر از       2/0
U5
 
 3/13

پرايمر Ns1      5/0
Mole  10

پرايمر Ns2      5/0
Mole  10

 
در مرحلة اول nested PCR از پرايمرهاي Ns2, Ns1 با توالي ؟ استفاده شد.
در مرحلة دوم  23 از آميزة PCR (كه در جدول 10-2 ذكر شده است) به  2 محصول مرحلة اول PCR افزوده شد.
جدول 11-2 : چرخة دمايي در مرحلة اول nested PCR
    زمان     دما
    5 دقيقه     Cْ94
    45 ثانيه     Cْ94
    45 ثانيه     Cْ63
    45 ثانيه     Cْ72
    10 دقيقه     Cْ72

در محل استخراج ONA  
Negetive sample) NS) براي كنترل آلودگي هنگام استخراج استفاده شد.
(Posetive sample) ps سرم مثبت براي كنترل استخراج DNA استفاده شد.
در PCR
NS  براي كنترل آلودگي درمرحله PCR
PS براي كنترل واكنش PCR و محلولهايش استفاده شد.

 محصول PCR در ژل آگارز الكتروفروزيس حاوي اتيديوم بر مايه به عنوان آشكار ساز، مورد بررسي قرار گرفت.
ژل الكتروفروز
يك روش ساده براي جداسازي، شناسايي و خالص سازي قطعات مختلف DNA است مولكول DNA  به علت داشتن گروه فسفات داراي بار منفي است. بنابراين در ميدان الكتريكي به طرف قطب مثبت حركت مي‌كند اندازه منافذ آگارز به غلظت قطعة مورد نظر وابسته است و قطعات DNA را بر اساس اندازه جدا مي‌كند.
موارد وسايل مورد نياز
-    آگارز
-    تانگ دستگاه الكترفروز
-    U.V Transilluminator
-    منبع تغذيه بري (power supply)
-    محلول Tris Acctate EDTA (TAE) محلول ذخيره 50 برابر غلظت TAE (50 X TAE) به صورت زير تهيه و در زمان مصرف با آب مقطر رقيق مي‌كنيم. يعني ml20 از بافر 5x برمي‌داريم و روي ml980 آب مقطر مي‌ريزيم تا حجم آن به 1 ليتر برسد.
TAE : 242 گرم تريس در 500 ميلي ليتر آب حل شده سپس 100 ميلي ليتر EDTA 5/0 مولار و 1/57 ميلي ليتر.
اسيد استيك گلاسيال به آن اضافه و با آب مقطر حجم محلول به يك ليتر رسانده مي‌شود. اين محلول در دماي اتاق نگهداري مي‌شوند. محلول اتيديوم برومايه (10 ميلي گرم  در ميلي ليتر) : يك گرم اتيديوم برومايه را در 100 ميلي ليتر DH2O حل شده و در شرايط محافظت شده از نور نگهداري مي‌شود.
بافر لودينگ  (Loading Buffer) : 350 ميلي گرم بروموفنل بلوويا 250 ميلي گرم زايلين سيانول درnol 33 تريس اسيدي (m:7/5) 150 ميلي مولار ح شد سپس 60 ميلي سير گليسرول و 7 ميلي ليتر آب مقطر اضافه مي‌شود.
تهيه ژل آگارزيك درصد براي الكتروفروز DNA
1-    در يك ظرف شيشه‌اي تميز يك گرم آگاز در 100 ميلي ليتر بافر TAE X مخلوط گرديد. مخلوط حرارت داده شد تا تمام ذرات آگارز حل گردد.
2-    پس از سرد شدن (دماي cْ60) مي توان ايتديوم برومايه را با غلظت 5/0 ميكروگرم در ميلي ليتر به ژل اضافه نمود و سپس به درون ظرف مناسب حاوي شانه منتقل گرديد.
3-    پس از آنكه ژل سفت شد شانه خارج گرديد و ظرف حاوي ژل درون تانگ الكتروفروز قرار داده شد.
4-    به اندازه كافي بافر الكتروفورز به آن اضافه شد تا به عمق 1mm روي ژل پوشيده شود. نمونه DNA بافر لودينگ مخلوط گرديده و به داخل حفرات لود شد  در كنار نمونه DNA، ماركر با وزن مولكولي مناسب نيز استفاده گرديد.
5-    الكترودها به منبع تغذيه الكتروفروز وصل گردد. ولتاژ روي 100-70 دست قرار داده شد به مدت 30 تا 45 دقيقه الكتروفورز انجام شد پس از پايان الكتروفروز قطع جريان برق روي صفحة دستگاه نوردهي فرابنفش قرار گرفت و با استفاده از پرتو فرابنفش به بررسي و مشاهدة بارز ما پرداخته شد. مي‌توان از دوربين عكاسي با فيلتر مخصوصUV براي عكس برداري از ژل استفاده كرد در حال حاضر دستگاههاي مستند سازي نيز موجود هستند كه كار تصوير برداري را تسهيل نموده‌اند.
براي كنترل الكتروفروز از ماركر استفاده شد كه از كيت Rocha با برحسب تجاري  (               ) و وزن مولكولي 100pb بود.


تكثير amplification
براي تعيين ژنو تايپ با استفاده از روش تعيين توالي، تكثير PCR صورت گرفت تا ميزان DNA به h100 برسد و مناسب براي اين روش شود براي اين كار مقادير مرحله دوم را 4 برابر كرده و يك محلول از اين مقادير تهيه شد.
خالص سازي محصولPCR
  DNA تكثير شده بوسيله‌ ؟؟ با بر حسب تجاري Roche و شماره كاتالوگ (1722668 ، 1732676) تخليص شد تا بدينوسيله محصول PCR را از قطعات DNA كوچكتر، پرايمرها، نوكلئوتيدها، پروتئينها از قبيل آنزيم Tag خالص نماييم. معرفهاي موجود در كيت


معرف    برحسب گذاري    
1- سبز رنگ    Binding Buffer     3D ML (150ML)
[3M g caninidine – thiocyanante , 10 mm tris – Hd , 5% ethanol (7/7), PH 6.6 (25C)
2- آبي     Wash Buffer     10 ML (50ML) add 40ml (200ml)
Ethanol p.a.
20 mm Nocl , 2mm Tris-Hd, PH 7.5
(25C) final concentrations after addition of ethanol]
3- بي رنگ     Elution Buffer     30 ml (30ml)
[10 mm Tris – Hd , PH 8.5 (25C)]
4     High pure filter tubes    One bag (5 bags) with 5 polylene tubes with two layers of glass fleece, for use of up to 700 ml sample volume
5    Collection tubes     One bag (5 bags) with 50 polypropylene tubes (2ml)
 
موارد لوازم براي خالص سازي (DNA)
1-    100، 200، 500، 50 ميكروليتري
2-    سرسيلرهاي استريل و فيلتر دار
3-    لوله‌هاي ميكروسانتريفوز ايندروف ml5/1
4-    سانتريفوژ روميزي
5-    Hiter
6-    ميسكر ورتكس
7-    اتانل (100-96%)
8-    دستكس لاتكس
9-    ظرف waste حاوي مادة ضد عفوني كننده
10-    DNA 100yl
11-    كيت خالص سازي Roche DNA
12-    هود كلاس II
مراحل انجام كار :
1-    در لولة ميكروسانتريفوژ ml5/1 فاقد نوكلئيد 100 از DNAي محصول PCR ريخته
2-     500 بافر شستشو به محتويات لولة سانتريفوژ افزوده شد
3-    محتويات لوله با دستگاه ميكروورتكس مخلوط شد
4-    لولة حاوي فيلتر استخراج در داخل لولة جمع آوري قرار داده شد، تمام محتويات موجود در لولة سانتريفوژ ؟ به لولة فيلتردار منتقل شد.
5-    به مدت S60-3 در g×14000 سانتريفوژ شد.
نتايج، حداول، منحني‌ها :   
از 120 نمونه گرفته شده از اهداء كنندگان خون 3 پايگاه يزد، اصفهان كرمان كه از لحاظ ؟ بودند پس از انجام PCR روي نمونه‌ها 71 نمونه بطور قطعي HBSAG بودند از بين اين 71 مورد 30 نمونه (10 عدد از هر استان، به علت بر هزينه بودن و دشوار بودن اين روش) انتخاب شد پس از تعيين توالي و آناليز بوسيله نرم افزار (        ) و ترسيم درخت فيلوزينگي همگي داراي ژنوتيپ بودند نتايج اين 30 نمونه بوسيله Blast نيز تاييد شد.
عفونت مزمن ويروس هپاتيت B يك بيماري وسيع و گسترده مي‌باشد كه پسش از 5% از جمعيت جهان را آلوده مي‌سازد.
HBV نمونه خاص ويروس مي‌باشد كه با ژنوتيپ‌هاي مختلف خود جلب توجه مي‌كند ويروس HBV داراي ناممكن ژنتيكي وسيع مي‌باشد در سال 1988 از كامو و ديگران براي اولين بار 4 ژنوتيپ A-D را بر اساس انشعاب و واگرايي 8 درصدي يا بيشتر ژنوم كامل HBV تعيين كردند در سال 1993 نورو و ديگران رشته‌هاي ژن S ژنوم HBV سابقاً طبقه بندي شده توسط اوكاموتو ر ا مورد مقايسه قرار دادند و آنها نشان داد كه كمترين تفاوت‌هاي توالي ژن S ميان ژنوم‌ها 1/4% مي‌باشد بعد از آن ژنوتيپ جديد به عنوان F , E با استفاده از تفاوتهاي حداقل 4 درصدي در سطح ژن S تعيين شدند و سپس ژنوتيپ‌هاي H , G اخيرا از كشورهاي بلژيك و آمريكاي مركزي گزارش داده شده‌اند بنابراين كلاً 8 ژنوتيپ HBV تا كنون مشخص شده‌اند ژنوتيپ A اكثرا در آمريكاي شمالي، هنر و آفريقا فراوان مي‌باشد ژنوتيپ‌هاي C , B در آسيا فراوان مي‌باشند و ژنوتيپ D در اروپاي جنوبي، خاورميانه، منطقه مديترانه و هنر يافت مي‌شود ژنوتيپ E در آفريقاي غربي و جنوبي فراوان مي‌باشد ژنوتيپ F در آمريكاي جنوبي و مركزي فراوان مي‌باشد و ژنوتيپ G در ايالات متحدة آمريكا و اروپا فراوان مي‌باشد.
و ژنوتيپ H در آمريكاي مركزي و كاليفرنيا فراوان مي‌باشد ژنوتيپ D ظاهراً در حوزة آبريز مديترانه و خاورميانه فراوان يافت مي‌شود و اين مسئله با محل جغرافيايي ايران در جهان منطبق مي‌باشد ژنوتيپ سازي HBV براي رونس ساختن مسير و بيماري زايي ويروس مهم مي‌باشد بويژه تعيين توالي رشته در ميان بخشهاي مختلف ويروس مهم مي‌باشد زيرا ژنوتيپ‌ها از لحاظ الگوي واكنش پذيري سرمي، بيماري‌‌هاي و عكس العمل در برابر درمان با همديگر فرق مي‌كنند.
روشهاي مختلفي براي تعيين ژنوتايپ ويروس هپاتيت B مورد استفاده قرار مي‌گيرد كه يكي از اين روشها تعيين توالي مي‌باشد. زماني كه طبقه بندي ژنوتيپي HBV مورد توجه قرار گرفت اولين گزارشات بر اساس مقايسه سكانس كامل ژنوم بود به تدريج بررسي سكانس ژنهاي تكي يا بخشهايي از ژن‌ها به منظور تسهيل مقايسه تعداد بيشتري از سويه‌ها مورد استفاده قرار گرفت ژنوتيپ‌ها از لحاظ الگوي واكنش پذيري سرمي، بيماري زايي و عكس العمل در برابر درمان با همديگر فرق مي‌كنند.
روشهاي مختلفي براي تعيين ژنوتايپ ويروس هپاتيت B مورد استفاده قرار مي‌گيرد كه يكي از اين روشها تعيين توالي مي‌باشد .زماني كه طبقه بندي ژنوتيپي HBV مورد توجه قرار گرفت اولين گزارشات بر اساس مقايسه سكانس كامل ژنوم بود به تدريج بررسي سكانس ژنهاي تكي يا بخشهايي از ژن‌ها به منظور تسهيل مقايسه تعداد بيشتري از سويه‌ها مورد استفاده قرار گرفت ژنوتاپيگ بر اساس مقايسه سكانس كامل ژنومي پر هزينه بوده و انجام آن در آزمايشگاههاي تشخيص طبي آن هم در حجم زياد به آساني امكان پذير نمي‌باشد اما دقيق ترين روش مي‌باشد و كشف و آشكار سازي جهش‌هاي شايع و غير شايع را امكان پذير مي‌سازد و در كل روش ايده الي مي‌باشد ما از اين روش براي تحقيق در مورد شيوع ژنوتيهاي HBV در بين اهداء كنندگان خون HBSAG قسمت در سه استان كرمان، يزد، اصفهان استفاده كرديم. اين اولين مطالعه در مورد شيوع ژنوتيپها در اين استانها مي‌باشد در اين مطالعه ژن پليمر از 30 واريتة HBV از 30 اهداء كننده خون تقويت و تعيين توالي شدند و با رشته‌هاي شناخته شده از Gene bank مورد مقايسه قرار گرفتند و درخت فيلوژنتيكي توالي اين واريته‌ها در مقايسه با رشته‌هاي شناخته شده از Geni bank ساخته شد آناليز فيلوژنتيكي نشان داد كه كل 30 واريته در انشعاب ژنوتيپ HBV D مي‌باشد اين مورد با مطالعات قبلي ايران بر روي اهداء كنندگان خون و بيماران انجام شده بود مطابقت داشت در مطالعه‌اي كه توسط amini و همكاران روي 5 نمونه صورت گرفت آناليز فيلوژنيكي ژنوم كامل آشكار ساخت كه تمام واريته‌ها بر ژنوتيپ D تعلق داشتند.
مطالعه ديگر در ايران توسط گودرزي و همكاران در سال      بر روي 10 بيمار HCC و دچار عفونت مزمن صورت گرفت بر اساس تعيين توالي و آناليز فيلوژنيكي PRES آشكار شد كه تمام واريته‌هاي جدا شده به ژنوتيپ D تعلق دارند.
در مطالعه اخير كه توسط sharifi و همكاران بر روي 405 اهداء كننده خون پايگاه تهران صورت گرفت بوسيله تعيين توالي و آناليز فيلوژنيكي مشخص شد كه همگي واريته‌ها داراي ژنوتيپ D هستند تمام اين داده‌ها با همديگر نشان مي‌دهد كه بيماران و اهداء‌ كنندگان ايراني تنوع ژنوتيپ سازي را نشان نمي‌دهند و همگي يك ژنوتيپ واحد را آشكار مي‌كنند.
و از ديگر نتايجي كه در اين مطالعه بدست آمد اين بود كه 30 واريته با يكديگر ارتباط نزديك و تنگاتنگ دارند و شباهت نوكلئوتيدها 100-97% مي‌باشد و تمام واريته‌ها داراي نوكلئوتيد بودند.
هنگامي كه رشته‌هاي بدست آمده از مطالعه فعلي با رشته‌هاي بانگ ژن در تحقيق BLAST مورد مقايسه قرار گرفتند بهترين انطباقها و امتيازها با كشورهاي خاورميانه بويژه ازبكستان، تركيه، عربستان و افغانستان مي‌باشد چندين گزارش ازخاورميانه دردسترس است كه همگي ژنوتيپ D را نشان مي‌دهند. مطالعه‌اي براي تعيين ژنوتايپ دربيماران تركيه‌اي دچار بيماري كبدي مزمن توسط در سال انجام گرفت مطالعة آنها متشكل از 25 اطفال بيمار و 29 بزرگسال بيمار دچار عفونت ويروس هپاتيت B مزمن بودند ژنوتيپ غالب در كل مواردشان ژنوتيپ D گزارش شد.
دو مطالعه در هند غربي و جزاير نيكوبار در سال (2003) ژنوتيپ D را ژنوتيپ غالب گزارش كردند در مطالعه‌اي كه توسط Kanji و همكاران در سال 2004 در روسيه بر روي 374 فرد در رده سني (1 الي 4ساله) متشكل از 195 بيمار دچار بيمار‌ي‌هاي كبدي و 179 بيماربرون بيماريهاي كبدي صورت گرفت ژنوتيپ اصلي توزيع شده در ميان آنها از نوع D (85%) بود.  
و در مطالعة ديگري كه توسط Hodgren و همكاران گزارش شد ژنوتيپ اصلي HBR در حال انتشار در ما را كه شهري كوچك در بخش جنوب شرقي روسيه مي‌باشد از نوع D مي‌باشد.
در مطالعه‌‌اي كه در سيري واستوني توسط Tallo و همكاران در سال 204 گزارش شد ژنوتيپ D به عنوان ژنوتيپ غالب است.
در يك مطالعه كه توسط Sallam و همكاران در سال 2004 بر روي 987 اهداء كننده خون بمن انجام شد افراد بومي ژنوتيپ D را نشان دادند.
درمطالعه‌اي كه توسط Addol-p و همكاران در سال 2007 بر روي 70 بيمار مصري كه ساحل 22 بيمار دچار شكل‌هاي حاد بيماري كبدي و 48 بيمار دچار هپاتيت مزمن ( CALL) صورت گرفت ژنوتيپ D بيشترين درصد از بين ژئوتيمهاي ديگر در اين بيماران دارا مي‌باشد و ژنوتيپ D در بيماران دچار (AH) به مراتب بيشتر از بيماران دچار AH كشف شد.
تاكور و ديگران به اين نتيجه رسيدند بيماران داراي واريته‌هاي ژنوتيپ D دچار بيماري كبدي مزمن و شديدتر مي‌باشند برعكس گاندي و ديگران نتوانستند به اين نتيجه برسند كه ژنوتيپ D روي عفونت HBV مزمن در بيماران هنري تاثير مي‌گذارد و در مطالعة ديگر شرون گرن و ديگران به اين نتيجه رسيدند كه ژنوتيپ D HBV با بيماري فعال تر مرتبط مي‌باشد.
طبقه بندي سرولوزيكي ايزوله‌هاي HBV بر اساس شاخصه‌هاي آنتي ژن سطحي آنها 4 سروتايپ اصلي (ayv, aw, adv, adw) و اسروتايپ فرعي تعيين شد سروتايپ‌هاي مختلف ويروس در اين 8 گروه ژنوتيپي جاي مي‌گيرند اين سرو تايپ‌ها وسيعاً با ژنوتيپ‌ها ارتباط دارند برخي ساب تايپ‌ها را مي‌توان در از يك ژنوتايپ يافت كه بيشتري در ژنوتيپ‌ها وارد مي‌سازد.
 

 
زير نوع‌هاي (subtybess) ويروس هپاتيت
در سال 1971 با استفاده از روشانيوديفيورن و آنتي سرمهاي پلي كلنال و الل   را كشف نمود. همچنين در سال 1972 bencroft  با همان با همان روشي كه Lobesver استفاده كرده بود شاخص   را كشف نمود در افرادي كه به عفونت HBV الوده شده‌اند پاسخ ايمني داريد شاخصه ايجاد مي‌شود. آنتي بادي ايجاد شده عليه شاخص به در مقابل همه ساب تايپ‌هاي متداول HBV ايمني مي‌دهد سال بدن اين شاخص آنتي ترنيك به احياء شدن و آلكيلاسيون نشان دهنده اهميت وجود باندهاي دي سولفيدي در بقاء اين شاخص و ناپيوسته بودن (conformational) آن است.
Wandy و همكارانش (1984) 15 اپي توپ را در شاخصه نشان دادند. اكثر اين ابي تويها در اثر احياء شدن و الكيلاسيون خاصيت آنتي ژنتيك خود را از دست مي‌دهد.
ساب تايپ هاي آنتي ژنتيك ويروس هپاتيت B داراي بخش جغرافيايي متنوعي مي‌باشند و در شناسايي خط سير عفونت، اسشتقلال عمودي و اتفاقي HBR كمك مي‌كند و به عنوان ماركرهاي اسيد ميولوژيكي ارزشمند براي تعيين منبع تيوع عفونت محسوب مي‌شوند ساب تايپ‌هاي ويروس هپاتيت B كه در نواهي كه به مدت طولاني از نواحي ديگر جدا شده‌اند به ندرت تغيير مي‌يابند.

 


انجام پایان نامه

برای دیدن ادامه مطلب از لینک زیر استفاده نمایید

سفارش پایان نامه

نقشه